D-阿洛酮糖(D-psicose/D-allulose)是D-果糖(D-fructose)C-3位的差向异构体,是一种重要的稀有糖,也是一种新型低热量甜味剂。D-阿洛酮糖在自然界中含量极少,主要存在于小麦、寻找更多甘蔗和甜菜糖蜜中。2011年,D-阿洛酮糖被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准为安全食品(Generally Regarded as Safe,GRAS),可用于一系列食品和膳食补充剂。研究发现,D-阿洛酮糖是食品中蔗糖的绝佳替代品,不仅能够作为低热量甜味剂用于饮料和膳食补充剂中,还具有多种生理功能,在降血糖、抗肥胖、抗动脉粥样硬化等方面具有重要作用。益生菌是指活的微生物,当给予足够的量时,会给宿主带来健康益处。益生菌通常被认为是安全且耐受性良好的,目前,已被证明在预防和治疗各种疾病(特别是涉及胃肠道疾病)方面具有显著效果。近年来,探索合生元(益生菌和益生元的组合)是否具有良好的生物活性以预防代谢性疾病的趋势正在兴起。本研究以D-阿洛酮糖和益生菌为切入点,将两者联合应用,主要研究内容包括以下几个方面:1.能够利用D-阿洛酮糖的益生菌菌株筛选研究。依据中华人民共国卫生健康委员会发布的《可食用菌种名单》和实验室保藏的菌种,筛选出30株益生菌作为出发菌株。在D-阿洛酮糖MRS培养基中培养,并以无糖MRS培养基和葡萄糖MRS培养基中生长为对照,通过测定菌株的生长曲线、活菌数和p H变化,筛选出在D-阿洛酮糖MRS培养基中能够正常生长的益生菌两株,分别为鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)217-189和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)217-176。结合相关文献调研和鼠李糖乳杆菌217-189、凝结芽孢杆菌217-176在不同MRS培养基中的生长状况,最终确定鼠李糖乳杆菌217-189为后续实验菌株。2.鼠李糖乳杆菌217-189利用D-阿洛酮糖的代谢机制研究。收集鼠李糖乳杆菌217-189在D-阿洛酮糖MRS培养基和葡萄糖MRS培养基中指数期的菌体,提取RNA后进行转录组测序,结果两者共差异表达了129个基因,其中下调了51个基因,上调了78个基因。对差异表达的基因进行分析发现,其中多与细菌磷酸转运酶系统(Phosphotransferase System,PTS)、塔格糖-6-磷酸途径、甘油途径、果糖途径有关,且相关基因都出现显著上调(P?upper genital infections3.18 pg/m L,IL-6的浓度下降了105.98±12.14 pg/m L,提高了抑炎因子IL-10的浓度30.45±0.21 pg/m L;同时对血清中胰岛素(selleck抑制剂Insulin,INS)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和肝脏中肝糖原含量或活性进行了不同程度的提升。通过对小鼠胰腺组织进行病理组织学观察和肠道菌群多样性分析发现,鼠李糖乳杆菌217-189联合D-阿洛酮糖可以恢复Ⅱ型糖尿病小鼠的胰岛萎缩,并且可以在一定程度上调节小鼠肠道菌群的平衡,使小鼠肠道菌群恢复正常状态,并且两者联合用药的缓解效果优于单独使用。4.大肠杆菌转化D-阿洛酮糖的发酵条件优化研究。通过构建含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase)的诱导型质粒p ET22b-psi和组成型质粒p LP3804-psi,并转到大肠杆菌DE3/XL1-Blue中进行诱导表达,并对发酵条件(诱导条件:培养基种类、诱导温度、诱导剂种类、诱导剂添加时间、金属离子、诱导时间和孵育条件:孵育温度、底物p H、底物浓度、菌体量、孵育时间)优化,利用HPLC检测D-阿洛酮糖含量,确定最佳反应条件下含p LP3804-psi质粒大肠杆菌转化D-阿洛酮糖的产率为33.91%,含p ET22b-psi质粒大肠杆菌转化D-阿洛酮糖的产率为17.81%。待体系稳定后,按2%比例接种植物乳杆菌217-8,37℃培养48 h后含p LP3804-psi质粒大肠杆菌体系中D-阿洛酮糖纯度为89.67%,含p ET22b-psi质粒大肠杆菌体系中D-阿洛酮糖纯度为27.30%,从而实现D-阿洛酮糖的高纯度生产,也为后续利用益生菌转化D-阿洛酮糖提供了基础。