研究背景:血管壁承受的机械力包括平行于血流的剪切力、周向的牵张力和垂直管壁的静水压力。这些生物力学的改变参与高血压及其并发症的发病和发展。剪切力发生改变(如层流变成湍流)可诱导内皮功能障碍,参与血管舒张、动脉粥样硬化、斑块进展和血管炎症等。牵张力改变可调节血管张力及血管平滑肌细胞的功能(如凋亡、增殖和迁移),参与血管重塑。静水压力是血管壁扩张的重要动力,其改变也可诱导内皮功能损伤,参与高血压发病。我们前期工作通过单细胞测序,发现高静水压力(High Hydrostatic Pressure,HHP)可诱导主动脉平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)分化为炎症亚群(表达CXCL2、CXCL3和CCL2等分子标记物)和内皮功能抑制亚群(表达AKR1C2、AKR1C3和PEDF等分子标记物),但其分子机制尚未明确。铁死亡是一种新型的非程序性细胞死亡,Aβ pathology其特征为铁过载、活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)积累、铁依赖性脂质过氧化和线粒体收缩。铁死亡是由胱氨酸/谷氨酸反转运系统(cystine/glutamate antiporter system,Xc-系统)功能障碍、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)消耗和谷胱甘肽依赖的抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)失活引发的。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂,由半胱氨酸合成,并依赖于GPX4氧化为氧化性谷胱甘肽(Glutathione Oxydized,GSSG)。同时,GPX4还在辅助因子GSH的存在下将细胞毒性脂质过氧化物(Cytotoxiclipid Peroxide,L-OOH)还原为低毒醇类L-OH。因此,GPX4/GSH是铁死亡的重要调节系统。过多的铁沉积诱导铁死亡参与心血管疾病的发生发展。重组人GPX4和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)可以逆转部分心血管损伤(如心肌梗死)。这些研究表明铁死亡是心血管疾病发病的重要病理生理机制。胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine γ Lyase,CSE)内源性产生硫化氢(Hydrogen Sulfide,H2S),发挥心血管保护作用,是L-半胱氨酸生成(GSH前体)的关键酶RSL3试剂。H2S可促进GSH合成、清除ROS、抑制GPX4活性和维持Xc-系统稳定性,以减轻结肠癌细胞的铁死亡。那么VSMC内源性CSE/H2S是否调节VSMC铁死亡,进而参与HHP诱导的主动脉平滑肌细胞新的表型转换是亟待解决的重要科学问题。本研究应用自发性高血压大鼠(Spontaneous hypertension rat,SHR)作为血管壁高静水压的动物模型,采用高静水压力培养VSMC作为细胞模型,观察VSMC新的表型改变及其铁死亡的相关性,进而通过敲除CSE或给予H2S供体,探讨其是否参与高静水压诱导的VSMC铁死亡的分子机制。研究方法:首先通过免疫荧光检测高血压患者及自发高血压大鼠(Spontaneous hypertension rat,SHR)主动脉 GPX4、CXCL2 及 AKRIC2 的表达。使用特定的静水压力装置对主动脉平滑肌细胞进行静水压培养,检测铁死亡相关指标。使用铁死亡诱导剂及抑制剂处理高静水压培养的主动脉平滑肌细胞,荧光染色检测铁死亡相关指标及CXCL2、AKRIC2的表达。高静水压下培养主动脉平滑肌细胞,检测CSE/H2S的表达,使用H2S供体处理细胞检测铁死亡相关指标。并构建CSE全身敲除老鼠,提取原代平滑肌细胞,检测WT及KO平滑肌细胞铁死亡指标。最后检测硫氢化钠(Sodium hydrosulfide hydrate,NaHS)和铁死亡诱导剂(1S,3R)-RSL3(RSL3)共处理高静水压下小鼠平滑肌细胞的铁死亡相关指标。研究结果:我们发现GPX4(铁死亡的核心调节因子)在SHR大鼠和高血压PS-341溶解度患者主动脉中表达显著下调,且与平滑肌细胞新型表型升高密切相关。原代培养小鼠主动脉平滑肌细胞,给予高静水压(200 mmHg)及正常压力(100 mmHg)处理,高静水压增加了 VSMC铁负荷、ROS产生和脂质过氧化;铁死亡标志分子如 Cyclooxygenase-2(COX-2)、Transferrin Receptor(TFRC)、Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 4(ACSL4)和 NADPH Oxidase 1(NOX1)的表达显著上调。同时,给予铁死亡抑制剂Fer-1可阻断HHP诱导的主动脉平滑肌细胞炎症(CXCL2表达)表型和内皮功能抑制(AKR1C2表达)表型。反之,铁死亡诱导物RLS3则增加了 HHP诱导的CXCL2和AKR1C2的表达。在机制上,HHP抑制主动脉平滑肌细胞CSE/H2S系统,进而降低GSH含量;补充H2S供体(NaHS)可提高主动脉平滑肌细胞GSH水平,减轻铁沉积、ROS和脂质过氧化产生,进而减轻HHP和RSL3诱导的铁死亡。研究结论:本研究证实,HHP通过下调主动脉平滑肌细胞CSE/H2S水平,引发GSH水平降低,导致铁死亡,从而导致VSMC炎症和内皮功能抑制表型的发生。本工作阐明了铁死亡在HHP诱导的VSMC新型表型转换中的重要调节作用,同时也解释了生物力学改变通过诱导平滑肌细胞铁死亡,进而引发血管炎症和限制血管舒张,从而加剧血管损伤(如动脉粥样硬化)的新机制。我们的研究还揭示了 ROS-GSH-iron-铁死亡信号级联在CSE/H2S心血管保护中的新途径。