研究背景与目的三氯乙烯(TCE)是一种氯化溶剂,可用于除去金属零件或镜头油脂。长期在工作环境中接触TCE的工人会出现一种过敏综合征,称之为职业性三氯乙烯药疹样皮炎(ODMT)。OMDT主要特征是皮肤损伤,如大面积皮肤黏膜过敏,并伴有发热、黄疸和淋巴肿大等现象,此外大部分患者还伴有肾功能异常,严重者甚至危及生命。多项研究发现病毒感染或再激活是OMDT发病的关键。本课题组前期研究表明,聚肌胞苷酸(Poly(I:C))作为一种病毒模拟物可增强TCE致敏引起的损伤。然而,Poly(I:C)在三氯乙烯诱导的肾损伤中是否起作用仍有待阐明。肾脏血管内皮细胞作为肾脏内高度分化的功能性细胞,是多种肾脏疾病中加重肾脏炎症反应的关键驱动因素和靶点,具有调节流向局部组织床的血流以及维系肾小球滤过屏障和肾小管的再吸收等功能。前期研究发现TCE致敏小鼠粘附分子表达增多,提示TCE致病过程中可能累及肾脏血管内皮细胞,肾内皮细胞损伤可能是导致肾脏损害的重要原因。为此,本课题建立了三氯乙烯致敏小鼠模型,并评估了小鼠肾损伤情况,尤其是肾内皮细胞功能障碍。进一步检测高迁移率族蛋白1(HMGB1)的活确认细节化情况,探讨Poly(I:C)在三氯乙烯致敏肾损伤中的作用。研究方法建立TCE致敏小鼠模型,选取6周龄雌性BALB/c小鼠63只,将其随机分成空白对照组(6只)、溶剂对照组(6只)、TCE处理组(25只)和TCE+Poly(I:C)联合处理组(26只),其中TCE+Poly(I:C)联合处理组是在终末激发前腹腔注射Poly(I:C)。末次激发24h后根据小鼠背部皮肤表现进行评分,划分成致敏组和未致敏组。无菌环境下取肾脏和眼球静脉血,检测血清Cre、BUN水平,HE染色检测小鼠肾脏结构损伤情况。Western Blot法检测肾脏TLR3、HMGB1、ac-HMGB1、Syndecan 1和GlypicGSI-IX溶解度an 1蛋白表达水平;Elisa检测外周血中HMGB1水平;免疫组化法检测肾脏VCAM-1、ICAM-1和E-selectin的表达;q RT-PCR检测HMGB1和TLR3的基因转录水平。研究结果1.皮肤致敏率:对照组和未致敏组小鼠皮肤色泽正常,TCE处理组和Poly(I:C)联合处理组小鼠背部皮肤出现红斑,致敏率分别为32%和34.61%。2.TCE致敏小鼠肾脏损伤:TCE致敏组BUN、Cre水平升高,Poly(I:C)显著上调了小鼠肾脏BUN、Cre水平;病理组织切片结果发现TCE致敏组小鼠肾脏组织血管管腔挤压变形、肾小球系膜增生,Poly(I:C)加重了小鼠病理变化。3.TCE致敏小鼠HMGB1核质移位:Elisa结果显示TCE致敏组小鼠外周血血清中HMGB1水平显著高于其他组别,其他组别差异无统计学意义;进一步对小鼠肾脏组织免疫组化检测,在TCE致敏组小鼠肾脏存在HMGB1的核质向胞外转移。4.TCE致敏小鼠肾脏内皮细胞活化:免疫组化结果显示TCE致敏组小鼠肾脏VCAM-1、ICAM-1和E-selection的表达均增加,TCE+Poly(I:C)致敏组更明显。其余对照组和未致敏组E-selection、VCAM-1和ICAM-1三组蛋白几乎无表达;Western Blot结果显示与TCE未致敏组相比,TCE致敏组小鼠肾脏Syndecan 1和Glypican 1的表达明显降低(P<0.05)。TCE+Poly(I:C)致敏组的Syndecan 1和Glypican 1的表达明显低于TCE阳性组(P<0.05)。5.Poly(I:C)预处理后TCE致敏小鼠肾脏TLR3过表达:免疫荧光实验表明与对照组相比,TCE致敏组小鼠肾脏中TLR3表达升高,而TCE+Poly(I:C)致敏组肾脏TLR3的表达高于TCE致敏组;Western Blot结果同样显示,与TCE致敏组相比,TCE+Poly(I:C)致敏组小鼠肾脏中TLR3蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);q RT-PCR数据进一步证实了TCE+Poly(I:C)致敏组TLR3m RNA表达水平更高。6.Poly(I:C)预处理可促进TCE致敏小鼠肾脏HMGB1核质移位:标记内皮细胞标记物CD31与HMGB1免疫荧光共定位,发现在Poly(I:C)dual infections处理后,TCE致敏小鼠肾脏内皮细胞中HMGB1出核情况更为明显;通过Western Blot评估小鼠肾脏HMGB1蛋白表达水平,溶剂对照组、TCE致敏组、TCE+Poly(I:C)致敏组的总HMGB1表达水平无显著性差异(P>0.05)。而与溶剂组相比,TCE致敏组的胞浆HMGB1水平升高。TCE+Poly(I:C)致敏组胞浆HMGB1水平显著高于TCE致敏组。相反,TCE致敏组的核HMGB1水平低于溶剂组,并且在TCE+Poly(I:C)致敏组中进一步降低。7.Poly(I:C)预处理增强TCE致敏小鼠肾脏HMGB1乙酰化:免疫荧光发现肾脏内皮细胞是ac-HMGB1的主要库之一;Western Bolt结果显示,与TCE未致敏组相比,TCE致敏组ac-HMGB1表达上调,而TCE+Poly(I:C)致敏组ac-HMGB1水平明显高于TCE致敏组(P<0.05)。结论1.肾脏内皮细胞激活和损伤参与TCE致敏小鼠肾结构和功能性损伤。2.Poly(I:C)的预处理与其配体TLR3结合放大TCE致敏小鼠肾损伤。3.Poly(I:C)促进HMGB1乙酰化并诱导核质移位参与TCE致敏小鼠肾脏内皮细胞损伤。