目的世界正在经历一个渐进的老龄化发展趋势。老龄化是机体不断衰老的过程,几乎影响人体所有的细胞、器官和系统,导致渐进的功能障碍和稳态失衡。衰老过程中最失调的系统之一是免疫系统,它在生理过程中发生了变化,对机体的整体健康产生了重大影响。细胞因子是免疫系统重要的组成部分,对炎症和免疫系统具有复杂的调节作用,并且对全身的器官系统有广泛的影响。然而老年人细胞因子的变化研究还不充分,仅限于主要的几种细胞因子,对于细胞因子谱的变化特征还罕见报道。那么老年人细胞因子谱的改变如何,是否会影响机体的免疫功能,进而加速衰老,这些都有待研究。本项目研究了老年人细胞因子谱的变化特征;分析了变化的细胞因子与常见临床检测指标的关系,明确了主要变化的细胞因子在转录组和蛋白层面对淋巴细胞功能的影响,为预防和延缓衰老提供新靶点,为临床衰老相关疾病的诊断和治疗提供新思路。方法一、研究对象研究对象入选标准:老年人组年龄大于60岁,年轻人组年龄小于45岁。没有明显的免疫性疾病、没有严重感染、肿瘤、心血管等重大疾病。根据上述标准获得冻存样本75例,其中年轻人组37例,中位年龄为33岁(四分位数间距:30-35.5岁),老年人组38例,中位年龄为66岁(四分位数间距:63-80 岁)。二、实验方法(一)细胞因子谱(48种细胞因子)的检测应用悬液生物芯片系统(BIO-PLEX 200检测系统),采用Bio-Plex ProTM Human Cytokine Screening Panel,48-Plex试剂盒,进行 48 种细胞因子检测。(二)转录组测定及分析提取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),实验组和对照组各5例,实验组加入浓度为1Ong/ml人重组血小板源性生长因子BB(Platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB),于培养箱中孵育 24h。由华大基因的BGISEQ测序平台完成转录组测序。(三)淋巴细胞抑制受体测定提取PBMC,分成实验组和对照组。实验组中加入浓度为50ng/ml人重组PDGF-BB,于培养箱中培养 24h。用荧光抗体 PerCP-Cy5.5 anti-human CD3、APC-Cy7 Mouse Anti-Human CD4、PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD56,BV510 Mouse Anti-Human PD-L2、FITC Mouse Anti-Human PD-1、PE Mouse Anti-Human LAG-3 进行细胞表面染色,流式细胞仪检测。(四)淋巴细胞增殖、衰老和凋亡测定获得T细胞和自然杀伤(natural killer,NK)细胞,采用相应流式染料APC-Cy7 Mouse Anti-Human CD4、PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD8、PerCP-Cy5.5 anti-human CD3、PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD56、Ki67-PE、FITC anti-human CD57、Annexin V和7-AAD进行表面染色和破核染色,流式细胞仪检测淋巴细胞抑制受体的表达。(五)淋巴细胞产生细胞因子的测定分离、活化及表面染色T细胞和NK细胞,在收细胞前6h(即第18h)加GolgiStop,待孵育后进行细胞表面染色。然后加破膜剂进行破膜及IL-2-APC、IFN-γ-APC以及FITC-TNF-α抗体染色,使用流式细胞仪检测白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、γ-干扰素(interferon-gamma,IFN-y)和肿瘤坏死因子 α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)。三、统计学分析本实验结果采用GraphPad Prism 8.0.2和SPSS 26.0软件进行统计学分析和绘制统计图。由于本研究数据大多为非正态分布,故两组数据比较用非参数Mann-Whitney U检验,两组配对数据比较采用非参数Wilcoxon符号秩和检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验。检验均为双侧检验,P<0.05具有统计学意义。研究结果一、老年人与年轻人比较48种细胞因子变化研究(一)老年人与年轻人比较,有10种细胞因子水平发生了变化老年人升高的细胞因子有5种:白细胞介素-3(interleukin-3,IL-3)(P<0.01)、干扰素 γ 诱导蛋白 10(interferon gamma-induced protein 10,IP-10)(P<0.05)、单核细胞趋化蛋白 3(monocytechemotacticprotein3,MCP-3)(P<0.001)、干扰素诱导的单核细胞因子(monokine induced by gamma interferon,MIG)(P<0.01)、PDGF-BB(P<0.001);老年人降低的细胞因子有5种:白细胞介素-9(interleukin-9,IL-9)(P<0.05)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)(P<0.01)、白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor,LIF)(P<0.01)、基质细胞源性因子1 α(stromal cell-derived factor 1 alpha,SDF-1α)(P<0.05)、肿瘤坏死因子 β(tumor necrosis factor beta,TNF-β)(P<0.01)。10 种变化的细胞因子在性别间无统计学差异(P<0.05)。(二)细胞因子(48种)之间的相关性分析对48种细胞因子水平进行相关性分析显示:多种细胞因子之间存在正相关关系(P<0.05),而IL-3、MCP-3与一些细胞因子存在负相关关系(P<0.05)。(三)对老年人10种差异细胞因子水平的相关性分析对老年人10种差异细胞因子水平的相关性分析显示,升高的细胞因子通常与降低的细胞因子呈负相关;升高的细胞因子内部之间呈正相关,降低的细胞因子也是如此。二、老年人差异的10种细胞因子与临床检验指标的相关性分析(一)老年人5种升高的细胞因子与临床检验指标的相关性老年人升高的细胞因子均与年龄呈正相关(P<0.05),且与红细胞分布宽度标准差(standard deviation,SD)呈正相关(P<0.05Wee1抑制剂),与估算的肾小球滤过率呈负相关(P<0.05),同时还与血清尿素、肌酐呈正相关(P<0.05),与空腹血糖呈正相关(P<0.05)。(二)老年人5种降低的细胞因子与临床检验指标的相关性老年人降低的细胞因子均与年龄呈负相关(P<0.05),与红细胞分布宽度SD负相关(P<0.05),与估算的肾小球滤过率呈正相关(P<0.05)。同时还与血清转氨酶呈负相关P<0.05),与空腹血糖呈负相关P<0.05)。(三)细胞因子PDGF-BB在老年人变化最大老年人细胞因子水平与年轻人比较,具有统计学差异的细胞因子有10种。对于这10种细胞因子,将老年人的细胞因子与年轻人相应细胞因子进行比较,其中细胞因子PDGF-BB比值变化最大,较年轻人升高了 2.31倍。三、细胞因子PDGF-BB在转录层面对PBMCs的影响PDGF-BB处理的实验组相比对照组上调基因共73个,下调基因共278个。对PDGF-BB实验组上调的差异表达基因进行蛋白互作网络分析发现,LAG-3、CD274、PDCD1LG2、IL-19、STAT1等基因为关键驱动基因,这些基因主要与抑制性受体和炎症相关。四、细胞因子PDGF-BB在蛋白层面对淋巴细胞受体表达及功能影响研究(一)细胞因子PDGF-BB对淋巴细胞抑制受体表达影响1.细胞因子PDGF-BB显著上调淋巴细胞表面LAG-3受体表达细胞因子PDGF-BB与PBMC共孵育24h后,流式检测结果显示:PDGF-BB显著上调淋巴细胞表面淋巴细胞激活基因-3(Lymphocyteactivationgene-3,LAG-3)在 CD4+T(P=0.0273)、CD8+T(P=Elexacaftor0.0488)、NK 细胞(P=0.0273)表达的百分比。2.细胞因子PDGF-BB显著上调淋巴细胞表面PD-1受体表达细胞因子PDGF-BB与PBMC共孵育后,流式检测结果显示:PDGFAnthroposophic medicine-BB显著上调程序性死亡受体 1(programmed cell death protein 1,PD-1)在CD4+T(P=0.0273)、CD8+T(P=0.0195)、NK 细胞(P=0.0488)表达的百分比。(二)PDGF-BB对淋巴细胞功能的影响1.PDGF-BB 下调了 T细胞的增殖能力PDGF-BB使CD4+T细胞Ki67表达百分比显著下降(P=0.0039),同时可使CD4+T细胞Ki67表达平均荧光强度也下降(P=0.0117);PDGF-BB使CD8+T细胞Ki67表达百分比显著下降(P=0.0039),同时可使CD8+T细胞Ki67表达平均荧光强度也下降(P=0.0195)。2.PDGF-BB促进了 NK细胞的衰老与PDGF-BB共孵育24h后,在CD4+T和CD8+T细胞上CD57表达百分比和平均荧光强度的变化都没有统计学意义,只有NK细胞表面CD57表达上调,无论是CD57百分比(P=0.0313)还是平均荧光强度(P=0.0156)的变化都具有统计学意义。3.PDGF-BB促进了淋巴细胞的凋亡对于CD4+T细胞,PDGF-BB处理后,其早期凋亡(P=0.0214)、晚期凋亡(P=0.0139)和总凋亡(P=0.0108)水平均升高,具有统计学意义;对于CD8+T细胞,PDGF-BB处理后,其早期凋亡(P=0.0164)、晚期凋亡(P=0.009)和总凋亡(P=0.0076)水平均升高,具有统计学意义。4.PDGF-BB下调了淋巴细胞产生细胞因子的能力接续研究了 PDGF-BB处理后淋巴细胞产生IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平。流式细胞术检测结果显示:PDGF-BB处理后,CD4+T(P=0.0117)、CD8+T(P=0.0273)和NK细胞(P=0.0078)产生的IL-2水平均下降。PDGF-BB处理后,CD4+T、CD8+T产生IFN-γ水平没有变化(P>0.05),但NK细胞产生IFN-γ水平下降(P=0.0122),具有统计学差异。结论1.本文首次比较了老年人和年轻人外周血浆48种细胞因子水平,发现老年人有5种细胞因子IL-3、IP-10、MCP-3、MIG、PDGF-BB升高,有 5 种细胞因子 IL-9、IL-10、LIF、SDF-1α、TNF-β 降低。2.老年人升高的细胞因子与年龄、血细胞生成异常、血清转氨酶水平等正相关;与估算的肾小球滤过率负相关;而降低的细胞因子与年龄、血糖、转氨酶等负相关,与白蛋白、估算的肾小球滤过率正相关。3.PDGF-BB是变化倍数最大的细胞因子。4.PDGF-BB在转录组水平促进了 LAG-3、CD274、PDCD1LG2抑制相关基因的表达。5.在蛋白水平,流式细胞术显示PDGF-BB促进了抑制受体PD-1,LAG-3的表达,抑制了淋巴细胞的增殖,促进了淋巴细胞的衰老或凋亡,降低了淋巴细胞产生IL-2和INF-γ的能力。