研究背景:阿尔茨海默病(AD)是一种以记忆缺陷和认知障碍为特征的神经退行性疾病,是老年痴呆症患者死亡的主要病因。AD标志性的病理学改变为大脑神经元外β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和神经元内Tau蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结。Aβ形成不溶性的寡聚体后毒性激增,过量的Aβ沉积可引起双重神经毒性作用。一方面,Aβ寡聚体可诱导小胶质细胞向促炎的M1型转变,M1型小胶质细胞持续分泌炎性因子并产生大量活性氧(ROS)损伤神经元;另一方面,Aβ寡聚体可诱导神经元线粒体通透性转换孔(m PTP)的异常持续开放,导致包括线粒体膜电位降低、ATP合成减少、线粒体超氧化物以及ROS水平升高、细胞色素c释放在内的线粒体功能障碍,引发神经元凋亡和神经退行性病变的进一步发展。因此,神经元线粒体功能障碍、小胶质细胞极化失衡导致的氧化应激和神经炎症越来越受到关注。临床研究显示,与普通人群相比,长期接受环孢菌素A(Cs A)治疗的器官移植患者,其AD发病率较普通人群显著降低。进一步查阅文献发现,Cs A通过抑制m PTP的异常持续开放,恢复并维持线粒体稳态,有效地保护神经细胞免受Aβ诱导的损伤,还能够促进受损神经元突触的生长。因此Cs A具有治疗AD的潜在能力。然而Cs A水溶性差,体内分布无选择性,如何将Cs A靶向运输到脑内损伤的神经元线粒体,是其用于治疗AD的关键。水溶性阳离子多肽SS-31可通过静电相互作用吸附于脑血管内皮细胞表面的阴离子位点,进而穿过血脑屏障(BBB)。同时SS-31能选择性富集于线粒体基质并抑制心磷脂氧化,发挥稳定线粒体膜和抗氧化的作用。据文献报道,酮缩硫醇(TK)能够特异性地在ROS的作用下断裂分解,因此采用TK将亲脂性的Cs A和亲水性的SS-31连接,合成的Cs A-TK-SS-31在水中自组装形成纳米胶束(CTS胶束),通过SS-31带动Cs A跨越BBB并靶向脑内神经元以及小胶质细胞的线粒体。目的:制备ROS响应的CTS胶束,通过恢复受损神经元以及激活态小胶质细胞线粒体功能,抑制受损神经元凋亡,促进激活态小胶质细胞向M2型转变,改善神经元所处的炎性微环境,恢复受损神经元功能,最终提高5×FAD小鼠的记忆和认知能力,为治疗AD探索新的治疗方法。方法:1.以Cs A、TK和SS-31为原料合成Cs A-TK-SS-31(CTS),采用核磁共振氢谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱对CTS的结构进行鉴定。2.通过水中自组装法制备CTS胶束,采用激光粒度分析仪、液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对CTS胶束的粒径、Zeta电位、稳定性、释药特性及溶血特性进行表征。3.采用CCK-8法检测CTS胶束对小鼠小胶质细胞(BV2细胞)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)和小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a细胞)活性的影响。4.建立Aβ_(1-42)诱导BV2细胞极化模型,通过倒置显微镜观察CTS胶束对经Aβ_(1-42)损伤的BV2细胞形态的影响,采用流式细胞术和ELISA法检测CTS胶束对经Aβ_(1-42)损伤的BV2细胞内ROS水平、炎性因子(IL-1β、TNF-α)和抑炎因子(IL-10)含量的影响。5.建立Aβ_(1-42)诱导SH-SY5Y细胞与N2a细胞损伤模型,通过倒置显微镜观察CTS胶束对经Aβ_(1-42)损伤的神经细胞形态的影响,采用流式细胞术检测CTS胶束对经Aβ_(1-42)损伤的神经细胞内ROS水平、线粒体超氧化物水平、线粒体膜电位、m PTP开放程度和细胞凋亡的影响,采用Western blot法检测CTS胶束对经Aβ_(1-42)损伤的神经细胞线粒体动力学相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响。6.将BV2细胞、SH-SY5Y细胞和N2a细胞共培养,采用激光共聚焦显微镜观察三种细胞对FITC标记的CTS胶束(FITC@CTS胶束)的摄取情况,采用流式细胞术检测三种细胞分别在正常状态下和经Aβ_(1-42)损伤后对FITC@CTS胶束的摄取情况。7.建立体外血脑屏障模型,通过激光共聚焦显微镜观察FITC@CTS胶束跨体外血脑屏障累积转运率,以及FITC@CTS胶束跨体外血脑屏障后与下室共培养的BV2细胞、SH-SY5Y细胞和N2a细胞线粒体共定位情况。8.采用携带五种家族性AD基因突变的APP/PS1转基因小鼠(5×FAD小鼠)模型,通过活体成像仪观察Cy5标记的CTS胶束在5×FAD小鼠体内和脑组织中的分布情况。9.采用旷场实验、新物体实验和莫里斯水迷宫实验考察CTS胶束对5×FAD小鼠空间学习记忆能力和认知指数的影响。10.采用H&E染色、尼氏染色、Neu N染色观察CTS胶束对5×FAD小鼠海马区和皮层神经元形态、尼氏体数量、功能状态的影响。11.采用透射电子显微镜、ATP试剂盒和Western blot法检测CTS胶束对5×FAD小鼠海马区和皮层线神经元线粒体的形态、能量供应功能和线粒体分裂及融合相关蛋白表达的影响。12.采用硫磺素S染色和ELISA法检测CTS胶束对5×FAD小鼠海马区和皮层内Aβ斑块数量、可溶性和不可溶性Aβ_(1-42)水平的影响。13.采用流式细胞术、确认细节DHE染色、ELISA和Western blot等方法考察CTS胶束对5×FAD小鼠脑内小胶质细胞表型及海马区和皮层内ROS、IL-1β、TNF-α、IL-10含量以及凋亡相关蛋白表达的影响。14.采用H&E染色并通过全自动生化仪和血常规分析仪检测CTS胶束对正常小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和外周血中免疫细胞的影响。结果:1.基质辅助激光解吸飞行时间质谱确定CTS的精确分子量与理论值一致,核磁共振氢谱进一步确证了CTS的分子结构。2.CTS可在水中自组装形成临界胶束浓度为1.4μM的CTS胶束。透射电子显微镜显示CTS胶束外观为球形、尺寸分布均匀,激光粒度分析仪检测其平均粒径为102.6±5.1 nm,Zeta电位为21.5±4.3 m V,且5天内平均粒径几乎保持不变,多分散系数均小于0.2,显示出良好的稳定性。CTS胶束具有ROS响应的释药特性。CTS胶束浓度在50μM以下时溶血率在安全范围以内。3.CTS胶束浓度在50μM及以下时对BV2、SH-SY5Y和N2a细胞的活性无影响。4.CTS胶束能够恢复经Aβ_(1-42)损伤的BV2细胞的形态,降低BV2细胞内ROS和炎性因子IL-1β、TNF-α的水平,升高抑炎因子IL-10的水平。5.CTS胶束能够恢复经Aβ_(1-42)损伤的SH-SY5Y细胞和N2a细胞的形态,降低SH-SY5Y细胞和N2a细胞内ROS和线粒体超氧化物水平,抑制m PTP的异常开放,恢复线粒体膜电位和线粒体分裂及融合相关蛋白的表达水平,最终减少神经细胞凋亡。6.FITC@CTS胶束能被BV2细胞、SH-SY5Y细胞和N2a细胞有效摄取,且摄取量呈时间依赖性增加。与正常的BV2细胞相比,经Aβ_(1-42)损伤的BV2细胞对FITC@CTS胶束的摄取能力显著升高。与正常SH-SY5Y细胞和N2a细胞相比,经Aβ_(1-42)损伤的SH-SY5Y细胞和N2a细胞对FITC@CTS胶束的摄取没有显著性差异,表明Aβ_(1-42)的损伤不影响神经细胞对FITC@CTS胶束的摄取。7.CTS胶束能够跨越体外血脑屏障,累积转运率呈时间依赖性增加;CTS胶束跨越体外血脑屏障后能够靶向下室共培养的BV2细胞、SH-SY5Y细胞和N2a细胞线粒体。8.CTS胶束能够有效到达5×FAD小鼠脑内,在给药后6 h达到峰值;CTS胶束能够进入海马区和皮层的神经元内。9.旷场实验、新物体实验和莫里斯水迷宫实验表明CTS胶束能够系统性恢复5×FAD小鼠受损的空间学习记忆能力,提高认知指数,且不确认细节影响其自发性活动。10.CTS胶束能够恢复5×FAD小鼠海马区和皮层神经元的正常形态,升高尼氏体数量和Neu N的表达水平,显著改善神经元medication-induced pancreatitis的功能和状态。11.CTS胶束能够恢复5×FAD小鼠海马区和皮层神经元线粒体的形态,能够降低线粒体分裂相关蛋白DRP1和FIS1的表达,升高线粒体融合相关蛋白OPA1、FMN1、FMN2的表达,以及提高ATP合成水平,恢复正常的线粒体分裂融合动态平衡及能量供应功能。12.CTS胶束能够降低5×FAD小鼠海马区和皮层内Aβ斑块数量、可溶性和不可溶性Aβ_(1-42)水平,有效减少Aβ负荷。13.CTS胶束能够降低5×FAD小鼠脑内M1型小胶质细胞的极化比例,升高M2型小胶质细胞的极化比例。CTS胶束还能够降低海马区和皮层内ROS、IL-1β、TNF-α含量,以及Cleaved caspase-3、Caspase-3、Bax、Cytochrome c蛋白的表达,升高抑炎因子IL-10的含量以及Bcl-2蛋白的表达。14.CTS胶束在治疗剂量下对正常小鼠血清中ALT、AST、BUN、CREA和外周血中的免疫细胞没有显著影响,显示出较好的体内安全性。结论:CTS胶束具有线粒体靶向以及ROS响应释药特性。CTS胶束能够有效蓄积于5×FAD小鼠脑部,通过减少线粒体分裂蛋白的表达并升高融合蛋白的表达,恢复神经元受损线粒体的形态,增加ATP的合成,改善神经元线粒体功能障碍,减少神经元的凋亡、变性和丢失,恢复受损神经元的功能。另外,CTS胶束还能通过减少Aβ斑块数量,降低可溶性和不可溶性Aβ_(1-42)水平,减少小胶质细胞向M1型极化,升高M2型小胶质细胞的比例,减少ROS及炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌,改善脑内炎性微环境。总之,CTS胶束通过改善神经元所处的炎性微环境,恢复受损神经元功能,提高5×FAD小鼠的记忆和认知能力,具有治疗AD的潜力。