神经干细胞(NSCs)是神经系统中一种具有自我更新能力和多向分化潜力(可分化为神经元和胶质等神经细胞)的细胞。外源性NSCs可植入成人神经系统并通过局部环境调控其分化方向,实现神经干细胞的治疗作用。神经干细胞疗法为难以治愈的神经退行性疾病和神经损伤的治疗带来了希望。移植的NSCs在病灶区可以通过分化为目标神经元从而替换受损神经元重新整合固有神经回路,或通过分泌作用释放可溶性分子为宿主神经元提供营养支持从而调节神经回路。但是,依赖于NSCs自发分化能力,移植的NSCs在体内向神经元分化的比例极低,且分化的神经元很难具有功能性,限制了神经干细胞疗法的临床应用。自伽伐尼于18世纪90年代首次发现生物电现象以来,大量电生理学证据表明,电活动在神经发育、修复和再生中起着至关重要的作用。基于这一生理学原理的电刺激已被应用于促进神经元发育、突触发生、神经元募集和神经元存活的各项研究中。特别是对NSCs命运的调控,由于作为分化目标的神经元是一种电兴奋性细胞,因此电刺激成为促进NSCs向神经元分化最直接和有效的方式之一。但是传统的施加电刺激方式大多需导线连接体内电刺激位点和外部电源,极易引起感染,这极大限制了其临床应用。虽然目前出现了各种可以介导无线电刺激的材料或器件,但遗憾的是现有的介导无线电刺激的光电响应、压电响应和磁电响应的材料或器件存在对外界能量利用率低、难以用于深部组织的NSCs电刺激、对外界能量发射设备耦合要求高、作用机制不明确以及未证明所促进分化的神经元具有功能性等缺点。基于上述原因,迄今为止还没有材料或器件介导无线电刺激促进NSCs向功能性神经元分化在神经退行性疾病和神经损伤治疗中的应用探索。基于以上问题,本论文旨在设计和制备能够有效介导无线电刺激的纳米材料,并将其应用于调控NSCs的神经分化过程,最终获得成熟的功能性神经元。在此基础上通过RNA测序和蛋白印迹分析等手段探究纳米材料介导无线电刺激促神经元分化机制,证实了电刺激激活电压门控离子通道,触发下游信号通路在神经元分化中的重要作用。进一步制备了柔性基底的纳米材料介导产生无线电刺激,并辅助移植的NSCs应用于神经系统损伤修复。最后,构建细胞-材料交互界面,实现细胞粘附牵引力触发无线电刺激定域定向调控自身命运。本论文主要包括以下三个方面的工作:(1)金纳米条纹阵列介导的无线电刺激加速功能性神经元分化以廉价的DVD光盘为模板,通过纳米压印光刻技术在硅基底上制备了宽度为550 nm、间距为200 nm的金纳米条纹阵列(AuNS阵列)。基于法拉第电磁感应原理,将AuNS阵列置于旋转钕铁硼磁体产生的旋转磁场中,AuNS阵列与磁场作相对运动,从而产生促进NSCs向神经元分化的可控无线电刺激。细胞相容性实验表明AuNS阵列和旋转磁场对于NSCs生存能力没有任何不利影响。体外NSCs分化实验显示,在不施加任何生化诱导因子的情况下,AuNS阵列介导的无线电刺激有效促进了 NSCs中神经元特异性标记物Tuj1和MAP2在基因和蛋白水平的表达,表明促进了 NSCs向神经元方向分化,并且所分化的神经元表现出更长伸展的轴突和具有复杂多极化特征的突触。在乙酰胆碱和γ-氨基丁酸两种神经递质作用下,分化的神经元呈现出Ca2+荧光强度变化,表明在AuNS阵列介导的无线电刺激下NSCs分化5天即可形成成熟且具有功能的乙酰胆碱能和γ-氨基丁酸能神经元,相比于未施加刺激的NSCs分化为成熟神经元至少提前5天。通过RNA测序进一步探究无线电刺激促神经元分化机制,结果表明AuNS阵列介导的无线电刺激可有效激活NSCs上的电压门控离子通道,从而触发下游信号通路加速神经元分化。Western Blot分析进一步验证了无线电刺激NSCs向神经元分化过程中Ca2+内流标记蛋白c-Fos和磷酸化Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的蛋白表达量升高。这种相应蛋白表达量升高的现象被CoCl2(非特异性电压门控Ca2+通道阻断剂)处理NSCs后阻断,进一步验证了电压门控离子通道的激活和Ca2+内流在无线电刺激NSCs向神经元分化中的重要意义。上述工作揭示了一种加速NSCs向成熟的功能性神经元分化的新策略,将有助于提高移Glycolipid biosurfactant植的NSCs在神经退行性疾病和神经损伤中的治疗效益。(2)柔性金纳米条纹阵列介导无线电刺激辅助神经干细胞治疗用于硬被膜缺损修复为了探索AuNS阵列介导无线电刺激促NSCs向神经元分化的体内植入应用,以生物相容性的柔性PI薄膜为基底通过纳米压印光刻技术制备了可用于体内神经组织植入的柔性基底AuNS阵列(Soft-AuNS阵列)。Soft-AuNS阵列在旋转磁场作用下能够产生无线电刺激信号。将作为机械支撑层的Soft-AuNS阵列与作为生物整合层的NSCs相结合,构建人工活性双层复合膜。体外细胞实验表明Soft-AuNS阵列在旋转磁场作用下介导的无线电刺激在基因和蛋白水平均有效促进了 NSCs向成熟神经元分化。此外,这种无线电刺激还能够促进具有神经保护性作用的A2型反应性星形胶质细胞转化,减少具有神经毒性的A1型反应性星形胶质细胞的形成。这有利于移植的NSCs在与神经系统的生物整合界面中发挥更好的治疗效益。将人工活性双层复合膜用于硬脑膜缺损修补,植入7天后,显微计算机断层扫描图像显示,位于右侧硬脑膜缺损区的人工活性双层复合膜完整嵌合在颅骨边缘下,无移位和脱落。这得益于人工活性双层复合膜中的Soft-AuNS阵列作为与颅骨接触的机械支撑层的作用。此外,NSCs作为生物整合层实现了与脑组织的良好界面融合,有效避免了胶质瘢痕的包裹,缓解了宿主炎症反应。将人工活性双层复合膜植入模拟脑组织损伤的恶劣炎症细胞浸润环境,发现Soft-AuNS阵列介导的无线电刺激依旧能促进NSCs的存活和分化。为了进一步探索结合了无线电刺激和移植NSCs的人工活性双层复合膜在硬被膜缺损修复之外的治疗效益,将人工活性双层复合膜作为植入性硬脊膜用于脊髓损伤的修复。修复4周后有效改善了脊髓损伤小鼠的感觉和运动神经功能。这为将来无线电刺激辅助移植的NSCs用于神经退行性疾病和神经损伤的治疗提供了思路。(3)基于细胞牵引力触发压电响应的聚乳酸纳米柱阵列定域定向调控NSCs命运为了实现无外界能量输入时纳米材料介导无线电刺激调控NSCs命运,构建了 NSCs与纳米材料的双向交互界面。以阳极氧化铝纳米孔阵列为模板,通过高温纳米压印的方法制备了能够最大限度利用NSCs的粘附牵引力实现最佳剪切压电响应的长轴径比(5:1)PLLA纳米柱阵列(PLLA long nanopillar)。XRD结果显示高温挤压的过程增加了 PLLA longnanopillar的结STM2457分子量晶度,有利于其在剪切应力作用下实现更高的净极化,从而表现出更好的压电响应。PFM结果表明得益于形状结构和晶体结构两方面的协同作用,PLLA long nanopillar的压电响应相比较于PLLA平面薄膜显著提升。通过构建PLLA long nanopillar与NSCs双向交互界面,发现PLLA long nanopillar对NSCs具有良好生物相容性。NSCs的粘附牵引力能够有效触发PLLA long nanopillar中纳米柱的剪切弯曲形变从而产生压电响应无线电刺激输出调控NSCs神经分化命运。NSCs分化实验表明PLLA long nanopillar介导的无线电刺激在基因和蛋白水平有效促进NSCs向神经元分化,并且增加了分化细胞中Tuj1和MAP2阳性的成熟神经元的比例。进一步将高温纳米压印技术与微加工技术相结合,制备了可按需定制图案的PLLA longnanopillar。免疫荧光染色结果表明在PLLA纳米柱区域更多地实现神经元分化,在PLLA平面薄膜区域更多地获得了星形胶质细胞。据此,图案化的PLLA long nanopillar实现了对NSCs命运的定域定向调控。此外,通过Ca2+荧光探针染色直观地验证了 点击此处PLLA long nanopillar介导无线电刺激促神经元分化过程中NSCs内Ca2+含量的升高,进一步表明电压门控离子通道激活和Ca2+内流在无线电刺激促神经元分化中的重要意义。最后为了排除实验中引入的长轴径比PLLA纳米柱结构对于NSCs向神经元分化的影响,制备了具有相同长轴径比(5:1)但不具有压电响应的PDLLA纳米柱阵列(PDLLA long nanopillar)。体外细胞实验表明PDLLA long nanopillar在NSCs向神经元分化过程中无显著促进作用,这证实了 PLLA long nanopillar对神经元分化的显著促进作用得益于有效的压电响应产生的无线电刺激输出,而非纳米柱结构的影响。上述工作为更好地深入探索介导无线电刺激的纳米材料在无外界能量输入情况下对NSCs向神经元分化进行定域定向精确调控奠定了基础。综上所述,本论文制备了能够介导无线电刺激的纳米材料,对其生物相容性和在NSCs向神经元分化中的调控作用进行深入研究,并揭示无线电刺激促神经元分化涉及机制,进一步探索纳米材料介导无线电刺激辅助移植的NSCs在神经系统损伤修复中的应用。最后构建了细胞-材料双向交互界面,实现无需外界能量输入情况下细胞粘附牵引力触发无线电刺激对自身命运定域定向调控。这些研究和探索对实现无线电刺激辅助移植的NSCs在神经退行性疾病和神经损伤中的临床应用提供了指导意义,也为其它植入式医疗电子器件的创新和开发提供借鉴和启示。