衰老是机体分子、细胞、组织、器官功能乃至整体功能随着年龄的增长出现的衰退性变化和趋向死亡的不可逆过程。衰老与许多常见的老年性疾病包括阿尔茨海默病、冠心病、糖尿病、肿瘤和骨质疏松症等密切相关,而这些疾病都严重影响老年时期的生活质量。衰老过程受到机体内外许多因素的共同调控,主要与体内活性氧(ROS)的过量产生有关,该理论即为自由基学说。由于大脑对氧气和不饱和脂质的高需求以及抗氧化防御系统水平相对不足,大脑极易受到氧化损伤。因此,大脑衰老是衰老进程中最典型的表现之一。尽管衰老的过程是不可逆转的,但是可以通过合适的药物干预延缓衰老进程,并预防相关疾病的发生、发展。在抗衰老药物的研究领域中,天然药物因其悠久的历史和相对较少的副作用一直受到广泛的关注。在这些药物中,人参(Panax ginseng.C.A Meyer)作为我国最具民族特色的传统中药,因其“补五脏,安精神,定魂魄,止惊悸,除邪气,明目开心益智,久服轻身延年”之功而居于《神农本草经》的上品之首。人参在加工过程中一些代谢酶经过加热蒸制而分解失活,从而发生次级皂苷转化及美拉德反应(Maillard reaction,MR)使得不稳定成分转换为稳定成分,进而有效成分得以保存并增强了药物活性,其红参是最具代表性的。红参(Red ginseng,RG)为鲜人参根经蒸制后得到的炮制加工品,皂苷类成分为其最重要的活性成分,而现代药理研究表明红参中非皂苷类成分,尤其是氨基酸类成分也同样是红参发挥药效的重要物质基础之一。此外多项研究提示红参可能通过改善氧化应激反应发挥抗衰老药效,但具体的药效作用及机制尚未被证实。且由于红参中的活性成分丰富且复杂,究竟是哪些活性成分在红参发挥“抗衰老”药效中起主导作用目前尚不明晰。因此,本研究基于衰老的自由基学说,科学全面地验证红参中延缓脑衰老的药效物质基础及其分子作用机制,对诠释古籍记载“人参久服轻身延年”的现代科学内涵及后续红参抗衰老药物的研制开发具有重要意义。本研究构建多种脑衰老的体内外模型,以氧化应激为中心点,从动物水平、细胞水平、分子水平等多维度较为深入地揭示了红参中延缓脑衰老的药效物质基础及其发挥药效的具体分子作用机制,进一步挖掘红参及其活性成分的现代药用价值,并为临床探究脑衰老及其相关慢性疾病的治疗提供潜在靶点。其主要研究内容如下:1.红参提取物延缓D-半乳糖诱导小鼠脑老化药效作用验证本研究首先利用GEO数据库结合KEGG和GO分析对正常大鼠和老年大鼠的差异基因进行分析以找到衰老的潜在的分子靶点。结果显示:正常大鼠与老年大鼠的基因差异的生物过程(BP)主要与活性氧的生成、细胞增殖、神经元凋亡、长期记忆能力密切相关,表明活性氧的过量产生与衰老的进程可能为正相关,同时进一步佐证了“大脑衰老是衰老进程中最典型的表现之一”这一论述。基于上述信息,本研究构建了D-半乳糖(D-gal)诱导亚急性衰老小鼠模型,利用免疫荧光双染技术以MAP2为神经元标志物验证衰老蛋白p21在海马神经元中的具体表达位点以确定D-半乳糖诱导脑老化模型建立成功;同时,给予红参不同提取物(水提物和醇提物)干预,利用水迷宫和胆碱能试剂盒测定以监测小鼠的学习记忆能力。结果表明:D-半乳糖(800 mg/kg)处理后可明显促进衰老标志物p21在海马神经元中的表达,标志D-半乳糖诱导小鼠脑老化模型的成功建立;红参醇提物(RGAE,200 mg/kg)和红参水提物(RGWE,200 mg/kg)均能有效缓解D-半乳糖导致的小鼠基础代谢指标减缓和学习记忆功能减退情况。进一步通过组织病理学染色和尼氏染色发现红参提取物均能显著改善D-半乳糖导致的小鼠海马神经元结构病变及神经元流失导致的神经元密度降低等情况。可利用蛋白质印迹法(western blot,WB)技术监测小鼠海马神经元中衰老标志物p53、p21、p16蛋白,衰老分泌表型(SASP)蛋白(IL-6)及细胞周期蛋白CDK4表达变化情况以验证红参提取物对D-半乳糖诱导脑老化的延缓作用。结果证实,D-半乳糖处理后,导致衰老标志物p53、p21、p16及炎性衰老分泌表型IL-6蛋白表达升高,细胞周期蛋白CDK4表达降低;给予不同红参提取物处理后,可不同程度逆转这些蛋白表达水平,显示出良好的抗衰老活性。在验证红参提取物的抗衰老药效的基础上,利用液相色谱-质谱联用仪(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)技术明确了这两种红参提取物中的主要活性成分,为后期红参中药效物质筛选提供了物质基础。2.脑衰老细胞模型的建立及红参中药效物质抗衰老活性筛选基于自由基学说构建小鼠海马神经元(HT22)细胞亚急性衰老模型,即过氧化氢(H_2O_2)和D-半乳糖(D-gal)模型。利用western blot技术检测衰老标志物p53、p21、p16蛋白,炎性衰老分泌表型IL-6蛋白及细胞周期蛋白CDK4表达变luminescent biosensor化情况验证模型是否建立成功。结果表明:H_2O_2(3 h,40μM)或D-gal(3 days,55 m M)干预HT22细胞后,可明显促进p53、p21、p16、IL-6及MMP3蛋白表达并降低CDK4蛋白表达,标志亚急性细胞衰老模型的成功建立。按照人参皂苷、人参皂苷元、人参美拉德反应主要产物划分对鉴定得到的红参提取物中主要活性成分进行分类筛选,利用MTT及乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测筛选出可抵抗细胞活力降低的潜力活性物质,并通过western blot检测6种相关蛋白(p53、p21、p16、IL-6、MMP3及CDK4)表达变化对筛选得到的活性物质进行再验证,初筛出每种模型的最优活性成分进行初步交叉拟合,得到6种潜力活性物质,分别为人参皂苷Rg2(S型和R型),人参皂苷元PPD、PPT和人参美拉德反应产物—精氨酸双糖苷(Arginyl-fructosyl-glucose,AFG)、麦芽酚(Maltol)。之后,利用细胞流式仪检测细胞凋亡和细胞周期对两种模型筛选得到的6种活性成分(20μM)进行联合比对筛选,最终确定3个最佳潜力活性物质,即人参皂苷Rg2(S-Rg2),人参皂苷元PPT和美拉德反应产物AFG。以上结果表明这3种活性成分可能是红参延缓脑衰老的药效物质,为后续研究奠定基础。3.红参中潜力活性物质延缓D-半乳糖诱导小鼠脑老化的药效作用研究基于潜力活性物质(S-Rg2、PPT、AFG)对活性氧诱导剂诱导小鼠海马神经元细胞衰老的保护作用,进一步探究其在小鼠体内实验中对亚急性衰老小鼠脑老化的延缓作用。结果表明:潜力活性物质(S-Rg2(10 mg/kg,20 mg/kg),PPT(10 mg/kg,20 mg/kg),AFG(40 mg/kg,80 mg/kg))可以显著恢复D-半乳糖诱导的小鼠记忆功能受损,胆碱功能失调及氧化还原系统失衡。同时,潜力活性物质也显著减少了D-半乳糖引起的海马区域神经元结构松散、神经元密度降低、细胞核破裂及尼氏体流失等病理变化;在高剂量(S-Rg2(20 mg/kg),PPT(20 mg/kg),AFG(80 mg/kg))下,潜力活性物质对衰老相关蛋白(p53、p21、p16、IL-6)的抑制作用更显著。此外,利用透射电镜分析小鼠海马Galunisertib细胞培养神经元中线粒体数目、线粒体受损程度及自噬溶酶体个数,并联合western blot检测自噬底物(ATG3、ATG5、ATG7),自噬溶酶体形成的关键蛋白(LC3、p62)和溶酶体功能性蛋白(TFEB、LAMP2)表明潜力活性物质延缓D-半乳糖诱导亚急性衰老小鼠脑老化与ROS水平、线粒体自噬及溶酶体生物发生有关。该结果充分佐证了前期体外的研究结果,并初步揭示潜力活性物质发挥药效的分子机制可能与高通量活性氧水平诱导的线粒体-溶酶体损伤机制有关,为系统探究红参及其药效物质延缓脑衰老的分子机制提供新的思路。4.红参中潜力活性物质发挥抗衰老作用的分子机制研究构建小鼠胚胎成纤维细胞(具有高限制性传代特性)的自然衰老模型,利用细胞形态学分析、细胞骨架(F-actin)、western blot和实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,q PCR)确定小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,ICR-MEF)的衰老代数为P4代。给予潜力活性物质(S-Rg2、PPT、AFG,20μM)干预,可明显抑制衰老代ICR-MEF细胞在G1期滞留并增加细胞周期蛋白CDK4表达,从而促进细胞周期运转。同时,p53、p21、p16、IL-6寻找更多蛋白表达减少进一步佐证了潜力活性物质对衰老代ICR-MEF细胞的保护作用。Mito SOX Red(用于检测线粒体ROS)的结果进一步揭示潜力活性物质对线粒体氧化损伤的保护作用。通过透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)分析监测线粒体损伤程度,结果显示:潜力活性物质干预可明显改善衰老代ICR-MEF细胞的线粒体肿胀程度,缓解线粒体膜溶解及基质外溢现象。通过DQ Red BSA检测表明潜力活性物质处理后可显著促进衰老代ICR-MEF细胞的溶酶体消化功能。激光共聚焦手段联合Mito-Tracker Green(检测线粒体质量)、Lyso-Tracker Red(检测溶酶体酸度)探针检测潜力活性物质对衰老代ICR-MEF细胞的线粒体-溶酶体功能互作的影响。探针结果表明:潜力活性物质可显著增加线粒体-溶酶体探针的荧光强度,表明潜力活性物质可明显改善衰老代ICR-MEF细胞的线粒体-溶酶体的功能互作。此外,自噬底物(ATG3、ATG5、ATG7),自噬溶酶体形成的关键蛋白(LC3、p62)和溶酶体功能性蛋白(TFEB、LAMP2、Cathepsin B)的蛋白表达结果揭示:给予潜力活性物质处理可增加自噬通量,促进自噬溶酶体消化;结合衰老标志物蛋白表达情况和线粒体-溶酶体功能验证结果进一步证实了潜力活性物质的抗衰老作用与线粒体ROS(mt ROS)水平(关键点1)及线粒体-溶酶体介导的自噬通量(关键点2)相关。为了验证活性氧水平的关键性作用,上述细胞模型在给予潜力活性物质治疗基础上,联合ROS抑制剂-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)干预,明确了纠正mt ROS致线粒体-溶酶体功能互作障碍是潜力活性物质发挥抗衰老作用的关键。5.红参中潜力活性物质基于线粒体-溶酶体互作的延缓脑衰老机制验证由于线粒体自噬需要大量溶酶体的持续消耗,TFEB作为调控线粒体自噬和溶酶体生物发生的重要核转录因子,在维持线粒体自噬-溶酶体功能互作中发挥着关键性的作用。因此,本章在已构建的自然衰老细胞模型基础上,给予潜力活性物质和TFEB激活剂(TFEB activator 1)联合干预,评价潜力活性物质对TFEB核易位能力的影响及TFEB核易位能力对mt ROS水平及线粒体-溶酶体功能互作的影响,以明确促进TFEB核易位是潜力活性物质增加线粒体-溶酶体功能互作,进而增加线粒体自噬通量和溶酶体生物发生,从而下调ROS水平发挥抗衰老作用的关键。结果显示:较ICR-MEF-P4-潜力活性物质单独处理组相比,TFEB activator 1(1μM)与潜力活性物质(S-Rg2、PPT、AFG,20μM)联合处理延缓衰老代ICR-MEF细胞衰老的作用更强,证实促进TFEB核易位是潜力活性物质发挥抗衰老作用的关键。同时,较ICR-MEF-P4-潜力活性物质单独处理组相比,ICR-MEF-P4-潜力活性物质-TFEB activator 1联合处理组的促进自噬通量增加的能力(p62蛋白表达水平更低,LAMP2、Cathepsin B蛋白及TFEB核内蛋白表达水平更高)更强,表明潜力活性物质可以通过促进TFEB核易位增加自噬通量,进而清除受损线粒体并促进溶酶体生物发生。透射电镜分析,Mito Tracker Green探针,Lyso Tracker Red探针以及DQ Red BSA染色分析佐证了上述结论。此外,Mito SOX Red结果表明潜力活性物质可通过促进TFEB核易位下调线粒体ROS水平。在体外实验的基础上,进一步选择3月龄的SAMP8快速老化小鼠为研究对象(野生型SAMR1小鼠为对照组)对体外实验结果进行辅助验证。结果表明:潜力活性物质(S-Rg2(20 mg/kg),PPT(20 mg/kg),AFG(80 mg/kg))可显著增加TFEB蛋白在小鼠海马神经元细胞核内的表达水平,并降低衰老标志物p21蛋白在海马神经元内的荧光表达量。不仅如此,潜力活性物质可通过增加TFEB核内蛋白表达,进而促进线粒体-溶酶体功能互作,从而降低氧化应激水平延缓SAMP8小鼠脑衰老。以上结果揭示了TFEB核易位介导的线粒体-溶酶体功能互作是红参及其药效物质基础延缓脑衰老的最终潜在分子靶点。综上所述,本研究揭示了红参及其药效物质延缓脑衰老的具体作用机制是通过靶向促进TFEB蛋白核易位,进而增加线粒体自噬通量清除受损线粒体,并促进溶酶体生物发生,从而纠正线粒体氧化损伤介导的线粒体-溶酶体功能互作障碍发挥抗衰老作用。上述结论为红参作为抗衰老药物的研制开发提供了理论借鉴和数据参考。