真空冷冻干燥具有保护热敏物质、隔绝氧损伤、产品易复水等优点,是目前益生菌产业化生产应用最广泛的技术,但在较短的时间内,益生菌从冻干前高活性状态转变为干燥后休眠状态,细胞不可避免的受到冷冻和干燥损伤,导致干燥后存活率下降。关于益生菌冻干损伤和保护的问题已成为研究热点,但冻干过程中冰晶对菌体细胞的损伤机制尚缺乏研究。本文以长双歧杆菌BB68S为研究对象,探讨真空冷冻干燥过程菌体细胞损伤的阶段及部位,并解析冰晶对细胞的损伤规律,制定了靶向的调控措施保护细胞活性,提高真空冷冻干燥益生菌产业化生产效率,可促进国内益生菌产业的良性发展。本文主要研究结果如下:(1)通过考察真空冷冻干燥过程Bifidobacterium longum BB68S存活率变化,确定冻干过程细胞损伤主要发生在预冻阶段和升华干燥阶段,存活率分别下降14.1%和49.7%Regorafenib。预冻阶段菌体在低温下进行冻结,其中的自由水形成冰晶,对细胞造成机械破坏,该阶段主要是细胞壁的肽聚糖结构发生了显著性变化,其完整度由96.2%下降至68.2%,细胞壁损伤严重。升华干燥阶段冰晶在真空下升华,细胞内外水分大量散失,使细胞受到脱水损伤,该阶段主要是细胞膜的磷脂双分子层结构在脱水后发生了显著性变化,其通透性由9.1%上升至30.9%,细胞膜损伤严重,同时导致细胞内溶物外漏,特别是乳diABZI STING agonist供应商酸脱氢酶、β-半乳糖苷酶等胞内代谢关键酶渗漏到细胞外,降低细胞活性。(2)在冻干工艺其它参数不变的前提下,分别改变预冻温度和升华干燥温度,考察冻干过程冰晶的形成动力学和升华规律,并分析不同冰晶形成直径和升华速率对细胞壁quinoline-degrading bioreactor和细胞膜损伤的影响规律。结果表明,冰晶的形成与预冻温度有关,预冻温度越低,冰晶形成速率越快,形成冰晶直径越小,而冰晶形成直径大小直接影响细胞壁的损伤程度,发现只有通过-196℃预冻形成的冰晶直径大小(3.1μm)对细胞壁结构和完整度无显著性影响,其他预冻温度(-80～-20℃)下随着温度的降低,形成的冰晶直径逐渐减小(13.0～40.4μm),对细胞壁肽聚糖结构破坏程度逐渐减弱,细胞壁完整度也逐渐上升,但相对于冻干前细胞壁结构和完整度仍有显著性差异。冰晶升华速率主要由升华界面温度决定,受升华温度(板层加热温度)影响,升华温度越高,升华界面温度越高,在低于塌陷温度的范围内,冰晶升华速率越快,而冰晶升华速率直接影响细胞膜的损伤程度,升华温度在-40～-10℃范围时,物料未发生塌陷,冰晶升华速率为由0.24 mm/h上升至0.60 mm/h,细胞膜磷脂双分子层结构和细胞膜通透性变化逐渐减小,当升华温度上升至0℃及以上,升华界面温度过高,物料出现塌陷,细胞膜损伤大幅度上升。(3)根据冻干过程冰晶对细胞的损伤机制,从冻干温度和冻干保护剂两方面对冻干过程进行调控。结果表明,冻干温度调控:通过响应面试验对预冻温度和升华干燥温度进行优化,得到最优温度参数,预冻温度为-45.5℃,升华干燥温度为-6.5℃,验证结果显示调控后预冻过程冰晶形成直径由27.8μm显著性降低至16.7μm,细胞壁完整度由68.2%提高至78.5%,降低了冰晶形成对细胞壁造成的损伤;升华干燥过程冰晶升华速率由0.49%显著性提高至0.68%,细胞膜通透性由30.9%减少至18.7%,降低了冰晶升华对细胞膜造成的损伤。冻干保护剂调控:通过响应面试验对冻干保护剂进行优化,得到最优复合保护剂组合,脱脂奶粉10.7%、麦芽糊精12.4%、海藻糖6.8%、水70.1%,验证结果显示调控后预冻过程冰晶形成直径及升华干燥过程冰晶升华速率无明显变化,保护剂通过直接与细胞壁和细胞膜作用,减轻冰晶造成的损伤,预冻后细胞壁完整度提高至93.6%,升华干燥后细胞膜通透性下降为10.7%,降低了冻干过程冰晶对细胞壁和细胞膜的损伤。经过冻干温度和冻干保护剂调控,B.longum BB68S小试冻干存活率由29.1%提高至93.6%,调控效果显著。同时对B.longum BB68S、B.longum HYY0316、B.longum HYY0322三株长双歧杆菌进行中试生产验证,冻干粉活菌数和冻干存活率均显著性优于调控前。本研究解析了真空冷冻干燥过程细胞损伤阶段及影响因素,并解析了冰晶对细胞的损伤规律,为解决益生菌冻干损伤问题提供新的研究思路和参考依据。