炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种常见的慢性炎症性胃肠道疾病,由遗传因素、肠道上皮屏障损伤、肠道固有免疫障碍以及肠道微生物失调等综合作用所引起,主要临床形式为溃疡型结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD),由肠道上皮屏障损伤、遗传因素、肠道的固有免疫障碍以及肠道微生物失调等因素综合作用所引起。随着社会经济的发展,炎症性肠病患病率在我国呈逐年上升趋势。益母草碱是益母草的活性成分,作为中药单体具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多种生物活性。研究证实益母草碱可以调节多个信号通路,包括抑制Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核因子κB(Nuclear Factor kappa-B,NF-κB)的表达,抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路,抑制NF-κB和蛋白激酶B(Protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路,激活核因子E2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid-2 related factor 2,Nrf2)信号通路。目前鲜有关于益母草碱在结肠炎中作用的相关报道,其作用机制尚不清楚。本研究初步探讨了益母草碱在葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSSEvidence-based medicine)诱导的结肠炎小鼠模型以及脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的结肠上皮细胞炎症模型中起到的调节作用及相关机制。目的:1.研究益母草碱对DSS诱导结肠炎小鼠的保护作用。2.探讨益母草碱对结肠上皮细胞的保护作用。3.阐释Nrf2在益母草碱缓解结肠炎过程中的作用。方法:1.采用4%DSS饮水饲喂的方法建立结肠炎小鼠模型,随机将小鼠分为对照组、DSS组、DSS+益母草碱(7.5 mg/kg)组、DSS+益母草碱(15 mg/kg)组、DSS+益母草碱(30 mg/kg)组,分别测定每组小鼠的体重、疾病活动指数(Disease activity index,DAI)、结肠长度,收集每组小鼠的血清及结肠标本,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)测定每组小鼠血清标本中肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)-α、白细胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-1β含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测每组小鼠结肠标本中的TNF-α、IL-6、L-1β炎症因子m RNA水平;生化检测每组小鼠结肠标本中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平;荧光显微镜观察每组小鼠结肠样本中细胞凋亡情况;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测Gefitinib-based PROTAC 3溶解度每组小鼠结肠组织中凋亡相关蛋白兔抗人单克隆抗体(BCL2-Associated X,BAX)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)和cleaved-caspase-3的表达水平;WB检测每组小鼠结肠组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB、Nrf2和血红素加氧酶1(Heme Oxygenase 1,HO-1)的蛋白表达水平。2.体外培养人结肠癌细胞(HT-29)和人结肠癌细胞(Caco-2),分别用LPS处理两组细胞,细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖情况,确定两种细胞模型中益母草碱的最佳加药浓度和处理时间。3.筛选敲低Nrf2效果最佳的siRNA,体外培养HT-29和Caco-2细胞,分为正常组、阴性对照组及siRNA-Nrf2-1、siRNA-Nrf2-2、siRNA-Nrf2-3转染组,qRT-PCR检测Nrf2基因的沉默效果。4.用益母草碱和筛选出的si-RNA-Nrf2对两种细胞模型进行处理,分为6组:A组=HT-29或Caco-2;B组=HT-29或Caco-2+LPS;C组=HT-29或Caco-2+LPS+siRNA-Nrf2-NC;D组=HT-29或Caco-2+LPS+siRNA-Nrf2;E组=HT-29或Caco-2+LPS+益母草碱;F组=HT-29或Caco-2+LPS+siRNA-Nrf2+益母草碱)。CCK-8测定每组细胞的细胞活力;ELISA检测Nirmatrelvir体外每组细胞的细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)水平;流式细胞术检测每组细胞的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、MDA、SOD和GSH水平;线粒体膜电位检测试剂盒(Mitochondrial membrane potential assay kit with,JC-1)检测每组细胞的线粒体膜电位;WB检测每组细胞的凋亡相关蛋白BAX、cleaved caspase-3、Bcl-2的表达水平以及Nrf2和HO-1的表达水平。结果:1.益母草碱以剂量依赖的方式缓解DSS诱导的结肠炎小鼠的疾病表型,减缓体重下降、结肠长度缩短和DAI评分升高。2.益母草碱能降低DSS诱导的结肠炎小鼠血清炎症因子水平,ELISA结果显示:相比DSS组,益母草碱组DSS组的炎症因子水平显著降低(p<0.01);qRT-PCR检测结果显示:相比DSS组,益母草碱组TNF-α、IL-6、L-1βm RNA水平显著降低。3.益母草碱可以部分缓解DSS诱导的结肠炎小鼠的氧化应激反应。相比DSS组,益母草碱组MDA水平降低,呈剂量依赖性;相比DSS组,SOD和GSH水平升高,呈剂量依赖性。4.益母草碱能抑制DSS小鼠的肠道细胞凋亡,DSS组隐窝细胞几乎被破坏,TUNEL阳性细胞增加,益母草碱组抑制DSS诱导的细胞凋亡,凋亡相关蛋白BAX和cleaved-caspase-3在DSS组呈显著升高(p<0.01),在益母草碱组呈剂量依赖性降低,而BCL-2则相反。5.益母草碱抑制TLR4/NF-κB信号通路,激活Nrf2/HO-1信号通路。相比DSS组,益母草碱组TLR4和p-NF-κB蛋白表达降低,Nrf2和HO-1蛋白表达上升,且呈剂量依赖性。6.益母草碱通过激活Nrf2恢复LPS处理后的结肠上皮细胞的细胞活力。加入LPS后,HT-29和Caco-2的细胞活力均降低;siRNA沉默Nrf2后,细胞活力降低;加入益母草碱后,细胞活力增加;相比单独加益母草,同时加入益母草碱和siRNA-Nrf2后,细胞活力降低。7.益母草碱通过激活Nrf2降低LPS处理后的结肠上皮细胞的ROS水平。加入LPS后,HT-29和Caco-2细胞ROS水平均升高;siRNA沉默Nrf2后,ROS水平升高;加入益母草碱后,ROS水平降低;与单独加入益母草碱相比,同时加入益母草碱和siRNA-Nrf2后,ROS水平增加。8.益母草碱通过激活Nrf2抑制LPS处理后的结肠上皮细胞的凋亡。JC-1检测结果显示:加入LPS后,HT-29和Caco-2细胞的线粒体膜电位均升高;siRNA沉默Nrf2后,细胞的线粒体膜电位升高;加入益母草碱后,HT-29和Caco-2细胞的线粒体膜电位降低;与单独加入益母草碱相比,同时加入益母草碱和siRNA-Nrf2后,细胞的线粒体膜电位升高。流式细胞结果显示:加入LPS后,HT-29和Caco-2细胞的凋亡水平均升高,加入益母草碱后,HT-29和Caco-2细胞的凋亡水平降低;与单独加入益母草碱相比,同时加入益母草碱和siRNA-Nrf2后,细胞的凋亡水平升高。WB检测结果显示:加入LPS后,HT-29和Caco-2细胞中Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2和HO-1蛋白表达水平降低;siRNA沉默Nrf2后,细胞中Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2和HO-1蛋白表达水平降低,而益母草碱组则相反;与单独加入益母草碱相比,同时加入益母草碱和si-RNA-Nrf2后,细胞中Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2和HO-1蛋白表达水平降低。9.益母草碱通过激活Nrf2减轻LPS处理后的结肠上皮细胞的氧化应激反应。加入LPS后,HT-29和Caco-2细胞的MDA水平增加,SOD和GSH水平降低;siRNA沉默Nrf2后,MDA水平增加,SOD和GSH水平降低;加入益母草碱后,MDA水平降低,SOD和GSH水平升高;与单独加入益母草碱相比,同时加入益母草碱和siRNA-Nrf2后,MDA水平增加,SOD和GSH水平降低。10.益母草碱通过激活Nrf2降低LPS处理后的结肠上皮细胞的炎症因子表达水平,加入LPS后,HT-29和Caco-2细胞中炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平升高;siRNA沉默Nrf2后,炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平升高,加入益母草碱后,IL-6、IL-1β及TNF-α水平降低;与单独加入益母草碱相比,同时加入益母草碱和siRNA-Nrf2后,炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平升高。11.益母草碱通过激活Nrf2增加LPS处理后的结肠上皮细胞中Fe水平,加入LPS后,HT-29和Caco-2细胞中Fe水平降低;siRNA沉默Nrf2后,细胞Fe水平升高,加入益母草碱后,细胞Fe水平升高;与单独加入益母草碱相比,同时加入益母草碱和siRNA-Nrf2后,细胞Fe水平降低。结论:益母草碱可以有效减缓DSS诱导的结肠炎小鼠肠道的炎症反应、细胞凋亡和氧化应激。Nrf2基因参与了结肠上皮细胞炎症反应、氧化应激和细胞凋亡过程。益母草碱可以通过激活Nrf2抑制结肠上皮细胞的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡。