目的:研究白皮杉醇对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用,进一步探究白皮杉醇是否通过Nrf-2途径调控心肌细胞铁代谢以及降低胞内游离态亚铁离子水平从而抑制心肌细胞铁死亡,阐明其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制。该研究力图从新的视角探讨白皮杉醇抑制心肌细胞铁死亡介导心脏缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制,对临床上防治心肌缺血再灌注损伤提供理论与实验依据。方法:1.取C57B/L6雄性小鼠,分为Sham组、I/R组、I/R+PCT 10(mg/kg)组、I/R+PCT 20(mg/kg)组、I/R+PCT 40(mg/kg)组,白皮杉醇在术前3小时腹腔注射给药。给小鼠腹腔注射1.2%三溴乙醇(0.2 ml/10 g)麻醉,并在气管插管后用动物呼吸机通气。连接Ⅱ导联心电图(ECG),观察心电图ST段变化。在左侧肋骨第四肋间隙钝性分离皮肤及肌肉组织组织,使心脏暴露。结扎左冠状动脉前降支(LAD),0.5小时后解开结扎线,再灌注2小时。假手术组行同样Redox mediator的手术,不结扎LAD。超声心动图检测心功能变化;H&E及普鲁士蓝染色检测心肌组织病理损伤和铁离子水平;透射电镜观察线粒体变化;免疫组化检测Tf R-1及FPN1蛋白表达;蛋白免疫印迹检测Tf R-1、FPN1、GPX4等蛋白的表达。2.细胞随机分为以下实验组:(1)Control、(2)H/R组、(3)H/R+PCT-10μM组、(4)H/R+PCT-20μM组、(5)H/R+PCT-40μM组。为了探索Nrf-2在H/R中的作用及PCT抗心肌缺血再RSL3灌注损伤的作用机制,我们使用Nrf-2抑制剂ML385在下面的实验中进一步考察了PCT介导铁代谢抑制心肌细胞铁死亡的分子机制,具体实验如下:(1)Control、(2)H/R组、(3)H/R+PCT-40μM组、(4)H/R+ML385(1μM)组、(5)H/R+ML385+PCT组。对照组AC16细胞在正常大气条件下(37℃,21%O_2,5%CO_2)在正常培养基中培养。在H/R组中,将AC16细胞培养基替换为Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRB),置于缺氧培养箱(37°C,1%O_2,5%CO_2)中培养5个小时,后其中KRB缓冲液用普通培养基代替,在常氧条件下再孵育2小时。CCK-8、LDH检测细胞活力和损伤情况;荧光显微镜及流式细胞术检测细胞脂质过氧化产物和ROS水平;免疫荧光检测关键蛋白的表达水平;高分辨透射电镜拍摄非游离态铁晶格及晶格衍射条纹;蛋白免疫印迹检测Nrf-2、Tf R-1、FPN1等蛋白的表达水平。结果:1.与假手术组相比,I/R处理后小鼠心电图ST段显著抬高,小鼠心脏LVEF及LVFS值显著降低,PCT处理组可抑制I/R后小鼠心电图ST段抬高,小鼠心脏LVEF及LVFS值较I/R组升高。小鼠血清LDH、MDA检测结果显示,与Sham组相比,I/R组小鼠血清中LDH及MDA水平显著增加,SOD活性显著降低,与I/R组相比,PCT处理组小鼠血清中LDH释放量显著减少,MDA水平降低,SOD活性显著升高。小鼠心脏组织HE染色结果显示,I/R组小鼠心肌细胞出现空泡和大量炎性细胞浸润,PCT处理组小鼠心肌细胞空泡较少,炎性细胞浸润较轻,提示PCT干预可改善I/R后心肌病理性损伤。普鲁士蓝染色结果显示,PCT能够显著降低I/R后心肌组织中的铁离子。免疫组化结果显示,I/R组小鼠心肌组织中Tf R-1蛋白表达显著升高,FPN1表达显著降低,PCT处理组小鼠心肌组织中Tf R-1表达受抑制,FPN1表达上调。Westren Blot结果显示,I/R组小鼠心脏组织中Nrf-2、HO-1,FPN1表达显著下调,Tf R-1、ACSL4表达升高,PCT处理组小鼠心肌组织中Nrf-2、HO-1,FPN1蛋白表达显著上调,Tf R-1、ACSL4表达下调。2.CCK-8和LDH检测结果显示,PCT可显著增加H/R后AC16心肌细胞的活力,抑制LDH的释放,提示PCT对H/R后的AC16心肌细胞有保护作用。ROS及脂质过氧化产物的荧光拍摄和流式细胞仪检测结果显示,PCT可显著降低AC16细胞H/R后的过氧化产物。Fe~(2+)荧光试剂盒检测结果显示,PCT处理后AC16细胞中游离Fe~(2+)水平显著下降。PCT与Fe~(2+)反应产物吸光度、磁性检测、AM-2282 NMR及晶格衍射条纹结果表明PCT能够将游离Fe~(2+)转化为非游离的Fe_3O_4。免疫荧光结果显示,相对于H/R组,PCT能够上调AC16细胞H/R后Nrf-2和FPN1的表达,下调Tf R-1的表达。Westren Blot结果显示,与H/R组相比,PCT处理组AC16细胞中Nrf-2、FPN1、HO-1表达水平显著上调,Tf R-1、ACSL4的表达水平显著下调。结论:上述研究结果表明,白皮杉醇可通过Nrf-2途径调控心肌细胞铁代谢,并且将游离铁转化为非游离铁,从而减少细胞内游离态铁离子水平,减轻MIRI诱导的心肌细胞铁死亡。