目的:本研究旨在探讨瑞香狼毒挥发油提取物中单体氧化石竹烯的药效学活性,以及它抑制肝癌细胞的作用机制,为氧化石竹烯抗肝癌的作用提供有力的理论支持。方法:1.第一部分:(1)瑞香狼毒挥发油成分的提取分离:将瑞香狼毒饮片粉碎,加热蒸馏提取挥发油。(2)挥发油组分成分分析;使用气相质谱联机检测分析,最后在化合物库中比对,分析出挥发油所含有的化学成分。2.第二部分体外细胞药效学实验:(1)通过CCK8实验检测氧化石竹烯对人肝癌细胞HCCLM3细胞、HUH7细胞和Hepg2细胞的活力的影响,筛选出氧化石竹烯作用48 h的有效剂量以及HUH7细胞和HCCLM3细胞进行后续的实验检测;(2)将HCCLM3细胞和HUH7细胞分组为对照组(Control)、氧化石竹烯低剂量组(COL组)、氧化石竹烯中剂量组(COM组)和氧化石竹烯高剂量组(COH组);(3)光学显微镜下观察HCCLM3细胞和HUH7细胞形态;(4)结晶紫染色观察氧化石竹烯对HCCLM3细胞和HUH7细胞存活情况的影响;(5)伤口愈合实验检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞迁移的影响;(6)Transwell ~(TM)实验检测氧化石竹烯对HCCLM3和HUH7细胞迁移的影响;(7)活性氧(ROS)染色检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内活性氧水平的影响;(8)流式细胞术检测氧化石竹烯对HCCLM3和HUH7细胞凋亡的影响;(9)ABTS总抗氧化能力检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内抗氧化能力的影响;(10)DPPH自由基清除率检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内DPPH自由基清除能力的影响;(11)Iron Assay检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内铁离子含量的影响;(12)Ferro Orange检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内游离铁水平的影响;(13)Lipid peroxidation探针检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内脂质过氧化水平的影响;(14)线粒体溶酶体共染色检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内线粒体和溶酶体的影响;(15)基因沉默和过表达来检测氧化石竹烯对Protein Tyrosine Kinase抑制剂肝癌HCCLM3和HUH7细胞铁自噬的影响;(16)间接免疫荧光检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞铁自噬的影响;(17)Western blot检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内蛋白质表达的影响;(18)荧光定量PCR检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内相关基因表达的影响。3.体内动物药效学实验:(1)建立肝癌细胞HUH7裸鼠移植瘤动物模型;(2)分组:对照组(Control组)、顺铂组(Cisplatin,5 mg/kg)、索拉非尼组(Sorafenib,30 mg/kg)和氧化石竹烯三个剂量组(50、100、2c-Met抑制剂00 mg/kg);(3)记录裸鼠的体重、瘤重及抑瘤率;(4)微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定、羟自由基抑制能力测定和丙二醛(MDA)测定裸鼠血清中的抗氧化物质表达情况;(5)铁离子含量测定检测裸鼠血清中铁离子的含量;(6)HE染色鉴定裸鼠的移植瘤组织病理学变化;(7)普鲁士蓝染色观察裸鼠移植瘤铁沉积情况;(8)通过免疫组织化学法检测氧化相关蛋白和铁自噬相关蛋白在移植瘤组织中的表达情况。结果:第一部分:(1)瑞香狼毒挥发油经提取分离后,发现主要化学成分为R-α-Pinene,α-Caryophyllene,Caryophyllene oxide,4-Methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol,D-Limonene;并发现氧化石竹烯(Caryophyllene oxide)对肝癌HUH7细胞具有显著的抑制作用,且存在剂量依赖性。第二部分:(1)氧化石竹烯能抑制肝癌HCCLM3和HUH7细胞的增殖、迁移,诱导肝癌HCCLM3和HUH7细胞凋亡。(2)氧化石竹烯能促进肝癌HCCLM3和HUH7细胞内的活性氧积聚,抑制肝癌HCCLM3和HUH7细胞的总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力,抑制抗氧化蛋白Nrf2、HO-1、GPX4和NQO1的表达,引起细胞内的氧化应激。(3)氧化石竹烯能促进肝癌HCCLM3和HUH7细胞内铁离子含量升高,增强细胞内游离铁水平,从而促进肝癌HCCLM3和HUH7细胞内脂质过氧化水平升高,增加肝癌HCCLM3和HUH7细胞内溶酶体数量,促进自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达,从而促进细胞内自噬水平升高;同时,促进NCOA4蛋白表达和抑制FTH1蛋白的表达,促进细胞内铁自噬的发生。(4)氧化石竹烯能靶向调节肝癌HCCLM3和HUH7细胞内铁自噬相关蛋白的表达,促进si LC3Ⅱ和si NCOA4沉默后LC3Ⅱ和NCOA4蛋白的表达;抑制OEFTH1过表达后FTH1蛋白的表达;促进LC3Ⅱ和NCOA4的共定位,诱导细胞发生铁自噬,从而导致细胞死亡。第三部分:(1)氧化石竹烯可以显著抑制裸鼠移植瘤的生长,显著抑制HUH7荷瘤裸鼠肿瘤组织中KI67的表达,改善荷瘤裸鼠的生存状态,提高其生存质量。(2)氧化石竹烯可以显著抑制裸鼠血清中抗氧化物质GSH和羟自由基抑制能力,显著抑制裸鼠肿瘤组织中抗氧化蛋白Nrf2、HO-1、GPX4的表达,显著提高荷瘤裸鼠血清中的铁离子和丙二醛的含量,导致过度的脂质过氧化,引起体内氧化应激反应。(3)氧化石竹烯可以显著调控HUH7荷瘤裸鼠肿瘤组织中铁自噬蛋白NCOA4、LC3、FTH1的表达,显著促进HUH7荷瘤裸鼠肿瘤组织中铁沉积的发生,在肿瘤组织中引发铁自噬发生,诱导细胞死亡,从而抑制肿瘤组织生长。(4)氧化石竹烯可以导致裸鼠肿瘤组织发生病理形态改变,但不能使荷瘤裸鼠肝、心、脾、肺、肾内脏发生病理变化,证明其具有安全性。结论:在这项研究中,我们首先在瑞香狼毒挥发油中发现了氧化石竹烯,并通过使用发现氧化石竹烯能抑制两种肝癌HUH7和HCCLM3细胞的增殖,使细胞形态发生改变,抑制肿瘤组织的生长,并且影响细胞的迁移,增加了细胞的凋亡和死亡。在机制上,我们还进一步发现氧化石竹烯以剂量依赖性的方式促进Hendobronchial ultrasound biopsyCCLM3和HUH7细胞内ROS积聚,抑制细胞内自由基的清除,抑制抗氧化物质和抗氧化蛋白的表达,能增加细胞内Fe~(2+)的含量,致使细胞内发生脂质过氧化,增加肿瘤组织中的铁沉积,促进MDA脂质过氧化发生,致使细胞发生铁自噬,最终导致肝癌细胞的死亡。