猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的一种危害猪健康的传染病,主要表现为脑炎和心肌炎,在猪场广泛存在;该病毒可在多种哺乳动物间传播还可引起人的感染,对养猪业和公共卫生安全造成威胁。有研究表明EMCV的非结构蛋白2A蛋白与病毒抑制细胞凋亡作用有关,但其分子作用机制尚不清楚。本研究利用pull-down技术和蛋白质谱分析技术筛选了与2A蛋白相互作用的多个宿主蛋白,其中annexin A2蛋白与多种病毒感染密切相关,在病毒的附着、内化、运输以及调控细胞凋亡等方面发挥重要作NSC 119875小鼠用,但尚无关于annexin A2参与病毒调控细胞凋亡分子信号通路的研究。本研究阐明了annexin A2参与2A蛋白抑制凋亡的分子通路,为揭示EMCV分子致病机制以及设计新型抗病毒小分子靶点药物提供理论基础。EMCV通过裂解细胞释放成熟的病毒粒子,为了促进自身增殖和扩散,EMCV通过抑制细胞凋亡逃避宿主的防御。本研究在PK15宿主细胞中表达病毒2A蛋白,通过流式细胞术分析和检测caspase 3的激活水平,验明2A蛋白能够抑制细胞凋亡。利用Co-IP和激光共聚焦技术证明2A蛋白与annexin A2之间的相互作用,并利用si RNA干扰PK15和BHK21细胞中annexin A2表达水平后降低了2A蛋白抑制凋亡作用,表明annexin A2对病毒2A蛋白抑制凋亡具有重要作用。EMCV感染annexin A2表达抑制的细胞可导致细胞凋亡大幅度增加,病毒增殖被延缓。以上结果表明,EMCV感染过程中2A蛋白与annexin A2相互IDN-6556作用作用抑制细胞凋亡进而促进病毒的增殖和扩散。我们利用qRT-PCR技术和免疫印迹技术检测caspase 3、caspase 8、caspase 9、p53、c-Jun、JNK通路分子的表达情况,通过比较2A蛋白在表达不同annexin A2的细胞中引起相关通路因子表达的变化,明确了2A蛋白与aDigital PCR Systemsnnexin A2相互作用通过JNK/c-Jun分子通路发挥抑制凋亡作用。为了进一步验证2A蛋白与annexin A2互作抑制凋亡的作用,在2A蛋白C端以不同长度截短构建了两个2A蛋白截短体。通过Co-IP试验证明annexin A2与两个2A蛋白截短体不发生相互作用,在免疫印迹试验中两个2A蛋白截短体均不能引起细胞相关通路分子发生相应变化,说明2A蛋白C端区域是蛋白互作的关键位点。而后,通过q RT-PCR技术与免疫印迹技术检测EMCV感染细胞后相关通路分子的变化,表明EMCV感染初期通过JNK/c-Jun信号通路抑制细胞凋亡。综上所述,本研究通过pull-down和蛋白质谱技术筛选获得与2A蛋白发生相互作用的宿主蛋白annexin A2,利用si RNA干扰技术通过q RT-PCR和免疫印迹技术对其相互作用分子机制展开研究,阐明了2A蛋白抑制凋亡的作用方式和分子通路,进而揭示了EMCV通过2A蛋白抑制凋亡促进自身增殖的分子致病机制。