病毒是专性胞内寄生生物,完全依赖宿主细胞提供代谢物质和能量合成病毒的组成成分。不同病毒调控宿主细胞代谢重编程既有共性,也存在差异。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是有囊膜的单股正链RNA病毒,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前,关于PRRSV与宿主细胞代谢的互作研究报道较少。本论文开展了PRRSV感染IPAM细胞(永生化猪肺泡巨噬细胞)的非靶向代谢组学研究,解析了糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和脂质代谢与PRRSV的相互调控作用,为挖掘PRRSV的药物靶标、阐明PRRSV的致病机理提供理论参考。主要研究内容如下:1.非靶向代谢组学样品的制备与组学数据的初步分析基于本实验室前期PRRSV(WUH3株)感染IPAM细胞的多步生长曲线结果,检测PRRSV(0.5 MOI)在IPAM细胞中不同时间点(6 h、12 h和24 h)的感染情况,发现在感染后6 h可检测到子代病毒,在感染后24 h病毒感染率达90%以上。因此,于感染后6 h、12 h和24 h收集实验组及对照组样品,通过基于液相色谱-串联质谱的非靶向代谢组学技术对细胞的代谢物进行检测,建立多维统计分析模型(主成分分析和正交偏最小二乘判别分析),结合单维统计分析(t检验)筛选差异代谢物。结果显示,PRRSV感染IPAM细胞后6 h、12 h和24 h分别引起540种、612种和514种代谢物的显著改变,覆盖糖、氨基酸、核苷酸和脂质等代谢路径。2.代谢组学数据的聚类分析和验证对差异代谢物进行聚类分析发现:(i)糖代谢方面,PRRSV感染后葡萄糖含量降低,6-磷酸葡萄糖含量升高,三羧酸循环的大部分中间产物下调,磷酸戊糖途径的中间产物上调。推测PRRSV感染后葡萄糖偏爱性进入磷酸戊糖途径,可能为核苷酸和氨基酸的合成提供碳骨架;(ii)氨基酸代谢方面,PRRSV感染后大部分游离氨基酸含量下调,如谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸等;(iii)核苷酸代谢方面,PRRSV感染后AICAR(嘌呤核苷酸从头合成关Lipid-lowering medication键物质)、AMP和GMP上调,但嘌呤核苷酸的分解产物未上调;嘧啶核苷酸从头合成中间产物UDP以及分解产物均下调,推测PRRSV可能更倾向于胁迫细胞的嘌呤合成而不是嘧啶合成;(iv)脂质代谢方面,PRRSV感染后参与脂肪酸转运的肉碱类物质下调,参与构成生物膜的PC、PE类磷脂上调,推测PRRSV可能抑制脂肪酸β氧化,将脂肪酸转换为甘油磷脂等膜成分,以促进病毒粒子包装。为了确定代谢组学数据的准确性,首先通过葡萄糖标签转运实验和酶活试剂盒检测了PRRSV感染IPAM后糖代谢的情况,发现PRRSV感染selleckchem后细胞的葡萄糖摄入增加,6-磷酸葡萄糖脱氢酶(磷酸戊糖途径的关键代谢酶)的活性增强,表明PRRSV感染后葡萄糖分解进入磷酸戊糖途径的比例增加。进一步利用谷氨酰胺含量检测试剂盒检测发现,PRRSV感染IPAM细胞显著下调胞内谷氨酰胺的含量。以上结果均与代谢组学数据相符,说明代谢组学数据是可信的。3.PRRSV诱导谷氨酰胺分解参与嘌呤核苷酸的合成PRRSV感染显著下调胞内谷氨酰胺的含量,但其对PRRSV增殖Roxadustat的影响尚不清楚。通过RT-q PCR和TCID_(50)实验检测发现,用无谷氨酰胺的培养基进行培养时,PRRSV在IPAM中的增殖滴度显著降低,而回补谷氨酰胺分解代谢衍生物(α-酮戊二酸、非必须氨基酸和核苷)均能部分恢复谷氨酰胺缺失所抑制的PRRSV增殖,并以核苷的恢复效果最明显。为了确定调控PRRSV增殖的核苷种类,在谷氨酰胺缺失培养基中,外源添加嘌呤核苷酸(腺苷、鸟苷或次黄嘌呤)或嘧啶核苷酸(尿苷),结果显示回补嘌呤核苷酸可以部分恢复PRRSV的增殖,而回补嘧啶核苷酸不恢复PRRSV的增殖。说明PRRSV感染诱导谷氨酰胺分解可能参与嘌呤核苷酸的合成,进而促进自身增殖。4.嘌呤核苷酸合成有利于PRRSV增殖进一步检测了嘌呤核苷酸合成对PRRSV增殖的影响,发现嘌呤核苷酸从头合成抑制剂AVN-944显著拮抗PRRSV增殖,并且外源添加鸟苷可逆转AVN-944对PRRSV增殖的抑制作用,但抑制嘧啶核苷酸从头合成不影响PRRSV增殖,说明嘌呤核苷酸从头合成有利于PRRSV增殖。核苷酸的从头合成需要一碳单位以四氢叶酸为载体提供碳原子,于是检测了一碳单位对PRRSV增殖的影响,结果发现一碳代谢抑制剂SHIN1、叶酸代谢抑制剂MTX均可抑制PRRSV增殖,而回补一碳供体甲酸盐或次黄嘌呤可分别完全恢复SHIN1或MTX对PRRSV增殖的抑制作用,表明一碳单位促进PRRSV增殖,进一步证实嘌呤核苷酸从头合成促进PRRSV的增殖。此外,还发现嘌呤核苷酸合成补救途径抑制剂OA也能抑制PRRSV增殖,说明PRRSV可胁迫嘌呤核苷酸两种合成途径以建立最优感染。