当前,能源危机和气候问题日益加剧,全世界各国以实现“碳中和”和“碳达峰”为愿景,发展以可再生生物质为原料的生物“绿氢”越来越刻不容缓。暗发酵制氢技术产氢量高、操作简单,具有很强的工业发展潜力和技术经济性。然而,暗发酵过程中积累的挥发性脂肪酸(Volatile fatty acids,VFAs)对氢气(H_2)累积的抑制作用一直是一个难题,为了解决VFAs对产氢过程的抑制作用,并将VFAs进一步高值转化为高附加值的酯类化合物,本课题耦联暗发酵制氢过程与原位酯化过程,构建了稳定联产氢气和丁酸丁酯的混菌发酵体系,开展了如下研究:(1)有机溶剂-水双点击此处相系统中脂肪酶催化合成丁酸丁酯:针对发酵液中丁酸分离困难的问题,本文通过原位酯化的方式对丁酸进行原位分离和高值转化。首更多先探究了不同影响因素对有机溶剂-水双相系统中脂肪酶催化合成丁酸丁酯的影响,选择了十二烷作为萃取剂、脂肪酶Eversa(?)Transform 2.0为酯化反应的催化剂,以3 g/L丁醇和2 g/L丁酸的醇酸混合液为底物,十二烷与醇酸混合液之比为1:4,工作温度为35℃,反应p H值为4.0,加酶量为0.5%,十二烷中丁酸丁酯的含量达到2.11 g/L。脂肪酶Eversa(?)Transform 2.0在高醇酸摩尔比下有利于酯化反应向合成丁酸丁酯的方向移动。(2)混菌发酵联产氢气和丁酸丁酯体系的影响因素探究:针对联产体系中丁酸消耗速率和生成速率不匹配的问题,探究了影响混菌发酵联产氢气和丁酸丁酯的影响因素,包括脂肪酶添加量、底物浓度、丁醇添加量,最终确定了最佳的混菌发酵联产体系的工艺参数。以底物浓度24 g/L淀粉,萃取剂与发酵液之比为1:4,酶添加量为0.5%,十二烷中的丁酸丁酯达到8.66 g/L,氢气累积量3631 m L/L,相比于对照组氢气累积量提高58.17%,产氢得率为1.23 mol H_2/mol glucose,在产氢发酵结束后继续补料丁醇,丁酸丁酯在十二烷中的累积量进一步提升至24.38 g/L。(3)混菌发酵联产氢气和丁酸丁酯体系过程优化:为了提高目标产物氢气和丁酸丁酯的产量,进一步优化了联产体系的发酵过程。以3 g/L的丁醇浓度为投料量,分批多次进行丁醇补料,联产体系的氢气累积量在没有受到明显抑制的情况下,十二烷中丁酸丁酯的累积达到了22.40 g/L;以生物炭菌剂进行联产发酵,氢气累积量为3524 m L/L,十二烷中的丁酸丁酯达到25.99 g/L;碳酸钙的添加能显著缩短发酵的时间,氢气累积体积达到了3389 m L/L,并且明显地减弱了发酵液的酸化程度,使得发酵液p H达到了5.6以上,这种p H下不适合脂肪酶Eversa(?)Transform 2.0进行酯化反应,十二烷中丁酸丁酯仅达到了3.64 g/L;提升底物浓度至48 g/L淀粉,并辅加碳酸钙,联产体系氢气Median survival time累积体积达到10793 m L/L,相较于相同10 g/L碳酸钙添加浓度下低底物浓度24 g/L淀粉的批次发酵氢气累积量提高了211.78%,产氢得率为1.73 mol H_2/mol glucose,十二烷中丁酸丁酯的累积量分别达到21.08 g/L,产酯得率为0.10 g/g glucose。综上所述,为解决发酵液中丁酸积累对产氢过程的抑制,本文构建了混菌发酵联产氢气和丁酸丁酯的体系,将暗发酵制氢过程与原位酯化过程相耦合,一方面发酵液中积累的丁酸在脂肪酶的作用下转化为高附加值的丁酸丁酯,另一方面,该联产体系减弱了丁酸对氢气累积的抑制作用。本文构建的联产体系为其它短链脂肪酸酯的合成提供了技术和理论支撑,也可为暗发酵制氢与其它VFAs资源化的整合炼制过程提供思路。