背景:雌激素缺乏可抑制成骨细胞增殖、分化。传统补肾中药淫羊藿作为一种植物雌激素,其有效成分淫羊藿苷能够产生雌激素的部分效应。目的:通过磷酸化蛋白组学技术探究淫羊藿苷非核效应促进成骨细胞增殖、分化过程中可能涉及的信号通路,以及信号通路中磷酸化蛋白级联调控的可能机制。方法:通过新生SD大鼠获取原代成骨细胞并培养、鉴定,CCK-8法检测淫羊藿Semi-selective medium苷对成骨细胞活性的影响,合成并鉴定淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物。将原代成骨细胞传至第3代培养24 h后,分为6组:牛血清白蛋白干预组、PBS干预组、淫羊藿苷干预组、淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、雌激素受体拮抗剂ICLBH589临床试验I182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、MAPK/ERK1/2通路抑制剂PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组,分别在作用0,5,15,25 min时收集各组细胞,进行蛋白提取、酶解、肽段标记和磷酸化肽段富集,利用液相色谱-质谱联用(LC/MS/MS)技术进行磷酸化蛋白组学分析。结果与结论:(1)10μg/L淫羊藿苷可显著促进成骨细胞的增殖、分化;(2)淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物能够不透膜而诱导成骨细胞内ERK的磷酸化,证实了非核效应;(3)磷酸化蛋白组学结果显示:与淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组相比较,淫羊藿苷干预组、牛血清白蛋白干预组、PBS干预组、ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组差VX-661溶解度异表达蛋白分别为971个(上调499个,下调472个)、974个(上调509个,下调465个)、836个(上调377个,下调459个)、231个(上调126个,下调105个)、150个(上调65个,下调85个)。其中,在加入抑制剂的ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组表达蛋白下调(Fc值<0.8)的分别有65个、62个,大多参与mRNA的加工及稳定性调节、RNA剪接、蛋白质磷酸化、有丝分裂等重要生物学过程。通过KEGG分析,多集中在MAPK、蛋白质泛素化、mTOR、PI3K/Akt等信号通路;(4)结果证实了淫羊藿苷通过非核效应促进成骨细胞增殖、分化,与MAPK、蛋白质泛素化、mTOR、PI3K/Akt等信号通路相关。