研究背景儿童原发性肾病综合征以反复发作的蛋白尿为主要临床特点,蛋白尿是患儿肾病进展至终末期的高危因素,肾小球性蛋白尿形成的关键原因是足细胞损伤,但是迄今尚无特效的治疗方案。因此,从减轻足细胞损伤出发,寻找安全有效的治疗方式,将有助于改善原发性肾病综合征患者的预后。以往研究表明,通过激活自噬来减轻足细胞损伤的方式是切实可行的,我们的前期研究已证明海藻糖是一种安全的自噬诱导剂。因此,本研究拟研究海藻糖对足细胞损伤的治疗作用以及相关的分子机制。研究目的在足细胞体外损伤模型和阿霉素肾病大鼠动物模型上,探索海藻糖对足细胞中自噬水平及其细胞功能形态的影响,并明确其中的相关分子机制。研究方法1.使用阿霉素处理体外培养的足细胞,构建足细胞损伤模型,海藻糖干预受损的足细胞,通过细胞划痕实验、免疫荧光染色法观察海藻糖对足细胞迁移表型及肌动蛋白细胞骨架结构的变化;Western blot检测LC3、p62等蛋白的表达变化,评估足细胞的自噬水平,并检测细胞氧化应Nirogacestat激相关蛋白Keap1、Nrf2的表达。2.采用阿霉素构建阿霉素肾病SD大鼠模型,采用腹腔注射海藻糖溶液进行治疗,通过检测尿蛋白与尿肌酐比值评估尿蛋白排泄情况,检测肾病大鼠肾功能评估其治疗效果及其安全性;取材实验大鼠肾脏组织制作石蜡与树脂切片,通过HE染色光镜下观察肾组织病理改变情况;同时,制作电镜标本,采用透射电镜观察足细胞足突结构变化,评估足细胞形态功能变化。3.采用CRISPR/Cas9系统和NPHS2-Cre工具鼠构建足细胞p62特异性敲除C57BL/6J小鼠。收集小鼠尿液、血液,检测尿蛋白水平、血肌酐水平,评估肾功能状况,收集肾脏组织样本评估足细胞损伤:肾组织PAS染色,光镜下观察肾小球病理变化;透射电镜观察足细胞足突结构变化;取肾脏组织皮质层进行转录组,进行差异表达基因分析,以及GO、KEGG富集分析,明确p62在海藻糖抑制足细胞损伤中的作用selleck抑制剂机制及可能涉及的相关信号通路。4.体外培养足细胞p62特异性敲除C57BL/6J小鼠足细胞,观察肌动蛋白细胞骨架结构以及免疫荧光观察CaMK4蛋白的表达情况。研究结果1、阿霉素处理后,足细胞迁移能力显著减弱,而海藻糖可恢复足细胞正常的迁移能力,海藻糖保护了足细胞的正常功能及形态;海藻糖上调了足细胞中LC3、p62和Nrf2蛋白的表达,减少了 Keap1蛋白的表达。2、阿霉素肾病大鼠尿蛋白排泄显著升高,但腹腔注射海藻糖溶液治疗后,蛋白尿以及血肌酐显著下降;阿霉素肾病大鼠电镜下可见足突广泛融合,病理改变类似于MCNS,经过海藻糖治hepatic insufficiency疗后,足突融合现象显著减少。3、基因型鉴定显示足细胞p62特异性敲除C57BL/6J小鼠(NPHS2-Cre p62fl/fl)构建成功;与对照组小鼠相比,NPHS2-Cre p62fl/fl小鼠蛋白尿呈现下降趋势;而肾脏组织在光镜下及电镜下未见明显变化;模型小鼠肾脏皮质组织转录组测序分析结果发现钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK4)的表达亦显著下降。4、NPHS2-Cre p62fl/fl小鼠足细胞细胞骨架无明显变化;免疫荧光显示CaMK4在NPHS2-Cre p62fl/fl小鼠肾小球中表达减少。研究结论海藻糖可诱导自噬显著减轻足细胞凋亡与肌动蛋白骨架重排,降低阿霉素肾病大鼠模型的蛋白尿。此外,p62敲除对于足细胞的保护作用可能与CaMK4相关。图11 表2 参65