水貂出血性肺炎是严重危害水貂养殖业健康发展的重要疫病之一。在过去很长一段时间内,人们曾认为该病是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)感染所引起。但近十年的研究表明,P.aeruginosa单一感染对水貂致病性不强,难以引发出血性肺炎。本实验室前期研究发现,H9N2 IAV与肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)在水貂中广泛流行。与H9N2 IAV和P.aeruginosa共感染易引起水貂出血性肺炎一样,H9N2 IAV继发感染K.pneumoniae也会引发严重的肺炎。该研究使用本实验室从患有呼吸道症状的水貂中分离得到的MK/SD/F10/13(H9N2)与K.pneumoniae-SD-21菌株作为抗原,制备了H9N2 IAV-K.pneumoniae二联灭活疫苗。采用10日龄SPF鸡胚对MK/SD/F10/13(H9N2)进行培养,使用血凝试验(HA)测定H9N2 IAV滴度。将HA效价为2~8以上的H9N2 IAV病毒液进行混合。使用10日龄SPF鸡胚测定病毒液滴度,滴度为3.2×10~9 EID_(50)/m L。采用LB培养基进行K.pneumoniae-SD-21培养,测定滴度为3×10~9 CFU/m L,在6周龄昆明(KM)小鼠上测定LD_(50)为6.2×10~4 CFU。为筛选K.pneumoniae最佳灭活条件,向菌液中分别加入终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的甲醛溶液,置于37℃条件下作用12 h、24 h、36 h。向H9N2 IAV病毒液中分别加入终浓度为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的甲醛溶液,在37℃条件下作用14 h、16 h、18 h。结果显示,K.pneumoniae最佳灭活条件为加入终浓度为0.3%的甲醛溶液,在37℃条件下作用24 h。H9N2 IAV最佳灭活条件为加入终浓度为0.1%的甲醛溶液,在37℃条件下作用16 h。使用灭活的抗原液与氢氧化铝佐剂混合,分别制备H9N2 IAV-K.pneumoniae二联灭活疫苗、K.pneumoniae灭活疫苗、H9N2 IAV灭活疫苗。调整各疫苗的组分含量,H9N2 IAV组分的含量为3.2×10~8EID_(50)/m L,K.pneumoniae-SD-21组分的含量为5×10~8CFU/m L,氢氧化铝佐剂组分的含量为20mg/m L。参照《中华人民共和国兽药典》对本实验中所研制的疫苗分别进行相关检验。结果显示各项质量检测均符合相应要求。采用大剂量疫苗(400μL/只)注射小鼠,以检测疫苗安全性。结果显示,小鼠精神状态正常、食欲良好、无不良反应,符合灭活疫苗的安全性要求。使用昆明(KM)小鼠作为实验动物,检测所制备疫苗的免疫原性。将150只6周龄KM小鼠随机分为四组,其中A组30只、B组30只、C组30只、D组60只。A组每只小鼠注射200μL H9N2 IAV灭活疫苗,B组每只小鼠注射200μL K.pneumoniae灭活疫苗,C组每只小鼠注射200μL H9N2 IAV-K.pneumoniae二联灭活疫苗,D组每只小鼠注射200μL无菌生理盐水。第一次免疫时计为第0 d,第14 d时使用同等剂量疫苗或无菌生理盐水对小鼠进行第二次免疫。第7 d、14 d、21 d、28 d时,每组中随机选取5只小鼠眼球采血,制备血清。通过血凝抑制试验(HI)测定血清中抗H9N2 IAV抗体滴度。第一次免疫后7 d,H9N2 IAV灭活疫苗组与H9N2 IAV-K.pneumoniae二联灭活疫苗组小鼠血清中抗H9N2 IAV抗体HI效价分别为2~(7.75)与2~8;第28 d时,分别为2~(9.75)与2~(10);通过间接ELISA测定血清中抗K.pneumoniae抗体滴度。第一次免疫后7d,K.pneumoniae灭活疫苗组与H9N2 IAV-K.pneumoniae二联灭活疫苗组小鼠血清中抗K.pneumoniae抗体滴度为1:640;第28 d时,两组小鼠血清中抗K.pneumoniae抗体滴度均升高至1:40,960。结果显示,对小鼠进行两次免疫后,所制备的疫苗均能诱导小鼠产生相应抗体,且第二次免疫后抗体滴度较第一次免疫时有显著提高。第2LY2157299供应商8 d时进行攻毒保护试验,以评估疫苗保护效果。将Medicine Chinese traditionalD组小鼠分为D1组、D2组、D3组和E组,共计4组,每组10只。A组与D1组每只小鼠使用3.2×10~8EID_(50)H9N2 IAV滴鼻攻毒,B组与D2组每只小鼠使用3×10~7CFU K.pneumoniae滴鼻攻毒,C组与D3组每只小鼠使用3.2×10~8EID_(50) H9N2 IAV与3×10~7CFU K.pneumoniae滴鼻攻毒,E组每只小鼠使用无菌生理盐AG-221配制水滴鼻攻毒。攻毒3 d后,随机挑选每组小鼠进行组织病理学检测、细菌载量测定、病毒载量测定。结果显示,A组、B组、C组、D1组和E组小鼠均未死亡,D2组、D3组小鼠全部死亡。组织病理学检测发现,D1组、D2组、D3组小鼠组织器官中均出现不同程度的组织病理学变化,A组、B组、C组、E组小鼠无明显的组织病理学变化。采用平板菌落计数法对小鼠组织中的细菌载量进行测定。结果显示,D2组、D3组小鼠组织中K.pneumoniae载量显著高于B组与C组,且肺部细菌载量最高,分别为1.3×10~9 CFU/m L与1.66×10~9 CFU/m L。采用荧光定量PCR对小鼠组织中的H9N2 IAV病毒载量进行测定。结果显示,A组、C组小鼠体内均未检测到H9N2 IAV,D1组、D3组小鼠仅在肺脏中检测到H9N2 IAV,载量分别为10~(4.35)copies/μg与10~(3.59)copies/μg。研究结果表明,H9N2 IAV灭活疫苗可使小鼠抵抗H9N2 IAV的攻击,K.pneumoniae灭活疫苗可使小鼠抵抗K.pneumoniae的攻击,H9N2 IAV-K.pneumoniae二联灭活疫苗可使小鼠抵抗H9N2 IAV与K.pneumoniae共同攻击。综上所述,本研究所制备的H9N2-K.pneumoniae二联灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性,可提供良好的保护效果。