背景:急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种以肺实质弥漫性炎症和顽固性低氧血症为特征的临床危重症疾病。COVID-19大流行以来,与之相关的病例也随之增多。临床上,ALI患者肺部往往表现出强烈的炎症反应,活化的中性粒细胞和巨噬细胞会产生大量促炎介质,肺泡上皮细胞间与血管内皮细胞间屏障完整性也会受到破坏。因此,抑制过度的炎症反应和selleck SCH772984修复肺气血屏障完整性将会是治疗ARDS的重点思路。同时,诱导肺组织细胞线粒体出现不同程度的损伤,进而诱发线粒体功能障碍促使大量的活性氧(ROS)累积,并且当ROS超过体内抗氧化系统清除能力时,机体会呈现氧化应激状态。当下,中药单体作为一种潜在的临床用药其相关研究受到广泛的关注,氧化前胡素(OPD)是一种呋喃香豆素类化合物具有广泛的抗炎抗氧化的作用。因此,本研究通过探究氧化前胡素的抗炎、抗氧化途径,进而揭示氧化前胡素对ALI的保护作用及相关机制,为临床研发预防和治疗ALI/ARDS的药物提供分子生物学依据和新思路。方法:1.氧化前胡素在ALI中抗炎作用的研DNA biosensor究(1)构建LPS诱导的ALI小鼠模型,通过病理切片HE染色评价对照组和不同处理组间小鼠组织的病理损伤情况;(2)通过髓过氧化物酶(MPO)CX-5461说明书检测各组小鼠肺组织中中性粒细胞浸润程度;(3)使用实时荧光定量PCR和ELISA分别对肺组织、肺泡灌洗液(BALF)中的炎性因子IL-6,IL-1β,TNF-αm RNA转录水平和分泌水平进行检验;(4)Western Blotting检测MAPK和AKT/NF-κB通路相关蛋白的激活情况;(5)检测各组小鼠的肺湿干比重进而评估肺组织水肿情况;(6)使用Evans Blue染色法检测肺血管通透性同时测定肺泡灌洗液中总蛋白浓度水平;结合Western Blotting和免疫荧光方法检测肺上皮细胞Claudin 3、Occludin表达和分布,依此评估肺气血屏障的完整性。(7)在体外细胞水平的试验中:通过CCK8筛选合适的细胞给药浓度,RT-PCR、ELISA方法评估各处理组炎性因子IL-1β,IL-6,TNF-α的m RNA转录水平和分泌情况;Western Blotting检测MAPK和AKT/NF-κB蛋白的表达;免疫荧光观察P65的入核情况。2.氧化前胡素在ALI中抗氧化作用的研究(1)在ALI小鼠模型中,通过流式细胞术对ROS的累积情况进行检测;通过ELISA测定抗氧化酶SOD、GSH、CAT及MDA水平;(2)电镜下观察小鼠肺组织内线粒体结构变化情况;(3)RT-PCR和Western Blotting方法检测HO-1以及与线粒体动力相关蛋白Drp1、OPA1、Mfn2和线粒体转录因子A(TFAM)蛋白水平的表达。(4)在体外实验中,我们使用小鼠巨噬细胞(RAW267.4)和人肺泡巨噬细胞(AM)对上述体内结果进行验证。首先通过CCK8实验方法确定氧化前胡素保护肺泡巨噬细胞的最适浓度;(5)细胞免疫荧光实验分析氧化前胡素对HO-1表达影响;(6)细胞免疫荧光检测细胞ROS生成水平;电镜观察细胞线粒体结构变化情况;(7)通过JC-1染色和Mito-Tracker Red CMX Ros试剂检测了细胞的线粒体膜电位改变。(8)Western Blotting方法检测HO-1以及与线粒体动力相关蛋白Drp1、OPA1、Mfn2和TFAM蛋白水平的表达。结果:1.氧化前胡素通过缓解炎症反应进而减轻LPS诱导的ALI小鼠肺损伤(1)OPD能够显著改善ALI/ARDS小鼠模型中肺损伤程度,抑制BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。(2)肺组织内MPO活性,i NOS和COX-2蛋白表达呈下降趋势,MAPK和AKT/NF-κB蛋白磷酸化水平也被明显抑制。(3)OPD有效缓解了ARDS导致的小鼠肺组织的水肿情况,肺泡液中染料漏出量及肺泡灌洗液中的总蛋白浓度明显减少,紧密连接蛋白Claudin 3和Occludin也呈现上调表达。(4)体外试验中,氧化前胡抑制LPS诱导的i NOS、COX-2表达,细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌,MAPK和AKT/NF-κB蛋白磷酸化水平,以及P65的入核。2.氧化前胡素通过HO-1的介导线粒体动力学平衡及TFAM来缓解LPS诱导的ALI氧化应激水平(1)OPD降低ALI/ARDS小鼠肺组织中的ROS水平,抗氧化酶SOD、GSH、CAT表达增加,脂质过氧化产物(MDA)水平下降。(2)OPD有效缓解了肺组织细胞中线粒体的损伤情况,HO-1,OPA1,Mfn2及TFAM转录和表达水平升高,Drp1转录和表达下降。(3)同时在体外细胞试验中OPD促进了HO-1表达,减少ROS累积,恢复了线粒体膜电位,OPA1、Mfn2、TFAM上调表达,Drp1表达下调。与上述体内结果相一致。功能性抑制HO-1后,OPD对OPA1、Mfn2、TFAM和Drp1蛋白的调控能力消失,ROS累积增加,线粒体损伤再次出现,线粒体膜电位降低。结论:1.在体内外实验中,氧化前胡素减轻LPS诱导的ALI小鼠模型中的炎症反应,是通过抑制MAPK和AKT/NF-κB信号通路的活化有关。同时,氧化前胡素明显减轻了ALI小鼠模型中肺水肿程度,维持了肺气血屏障的完整性。2.本研究发现,氧化前胡素通过促进线粒体融合和生物发生来减轻LPS所导致的线粒体功能障碍,缓解了ROS过度累积和线粒体损伤引起氧化应激水平。在细胞水平上我们又进一步证明上述现象与氧化前胡素对HO-1的调节密切相关。综上所述,本研究从抗炎、抗氧化两个方面来揭示OPD对ALI小鼠的保护作用。体现了OPD作为一种临床备选药物的潜在价值,也为后续临床治疗和预防提供了理论依据及前期应用基础。