棉花是重要的经济作物和天然纤维的重要来源。近年来,我国棉花生产向新疆转移。新疆的气候条件及高度机械化等因素决定了棉花品种需具备早熟、株型紧凑、吐絮集中等特性。植物成花素(FT)和抗成花素(TFL1)激素系统协同调控营养生长和生殖生长,最终决定植物的株型结构。目前成花素-抗成花素系统在棉花育种改良中的应用还不成熟。通过CRISPR/Cas9敲除抗成花素基因Gh TFL1,得到的是极端矮化,极早开花的极端突变体,不具备育种利用价值。而基于CRISPR系统的碱基编辑技术(Base Editing,BE),可以在不切割DNA链的同时对靶基因进行定点的碱基突变,从而实现精细的基因调控。为了快速鉴定Gh TFL1基因核苷酸变异的功能以及挖掘具有重要农艺价值的突变体,本研究在棉花中建立和优化了多个碱基编辑系统,并利用这些高效碱基编辑工具对Gh TFL1进行高密度的碱基突变,从而获得大量中间表型的突变体材料,并从中发掘出控制棉花理想株型的新遗传位点,创制出株高适中、果枝缩短、株型紧凑以及生育期缩短的棉花新种质,实现Gh TFL1基因的快速定向进化。进一步,基于Gh TFL1碱基突变的材料,鉴定到Gh LSH6参与“成花素-抗成花素”系统的分子调控网络,为棉花理想株型的研究和创制提供重要的技术平台和遗传信息。主要取得了以下研究结果:1.针对动物中优化的多种类型的腺嘌呤脱氨酶,筛选Tad A6.3、Tad A7.8、Tad A7.9和Tad A7.10共4种腺嘌呤脱氨酶,基于Cas9变体(d Cas9,n Cas9)融合建立了8个腺嘌呤碱基编辑系统(Adenine Base Editing,ABE),并在异源四倍体棉花体内成功实现内源基因的A-to-G碱基编辑。基于编辑效率和编辑窗口的综合分析表明,Gh ABE7.10n编辑活性最佳,编辑效率高达64.9%。此外,采用50x高深度的全基因组测序(Whole Genome Sequencing,WGS)和全转录组测序(Whole Transcriptome Sequencing,WTS)对Gh ABE7.10n和Gh ABE7.10d编辑的棉花材料进行DNA和RNA水平的脱靶分析。结果表明,在DNA水平上,Gh ABE7.10表现出高特异性,没有产生基因组脱靶突变。在RNA水平上,由Tad A7.10的过度表达诱导产生了145个位于基因间区的随机SNV,在植物基因功能研究中可以忽略不计。随后Gh ABE7.10n编辑材料经后代分离筛选,成功获得无转基因但靶标位点有编辑的Transgene-free突变体,证明Gh ABE7.10n产生的编辑可以稳定的遗传。2.基于ABE系统在棉花中有效编辑的基础上,针对Gh ABE7.10n存在编辑窗口窄,效率低的问题,选取动植物细胞中高活性的Tad A8e,进一步优化开发棉花腺嘌呤碱基编辑系统Gh ABE8e。并对其在棉花中的编辑活性与特征进行评估。结果表明:Gh ABE8e编辑效率高达99.9%,平均为90.2%(sd=8.68),与Gh ABE7.10E-616452说明书n平均编辑效率(21.7%±13.7)相比,提高了4倍。Gh ABE8e显示出A4-A10的活性窗口,且可同时编辑3个基因组靶标位点。针对Gh ABE8e编辑获得的棉花材料,进行WGS和WTS来全面的评估Gh ABE8e的特异性。分析结果表明,Gh ABE8e在棉花的DNA和RNA水平上都没有产生依赖sg RNA的脱靶突变,由脱氨酶引起的DNA水平的SNV和Label-free immunosensorRNA水平SNV仅占总SNV的0.1%和0.3%。同样地,对Gh ABE8e编辑产生的后代Transgene-free突变体的分析,证明Gh ABE8e产生的编辑可以稳定的遗传。3.为了拓宽靶标位点的选择范围,利用识别PAM为TTTV的CRISPR-Cas12a系统,构建了Gh ABE7.10-d Cas12a和Gh ABE8e-d Cas12a碱基编辑器。Gh ABE7.10-d Cas12a和Gh ABE8e-d Cas12a在棉花基因组中编辑活性分析表明,两者均可在棉花A/T富集位点进行A-to-G的碱基编辑,但Gh ABE7.10-d Cas12a编辑活性较低,编辑效率在0.2%-0.5%之间;而Gh ABE8e-d Cas12a的编辑效率则可以达到1.5%,有效地拓宽了ABE的编辑范围。4.基于本课题组开发的棉花第一代胞嘧啶碱基编辑系统(Cytosine Base Editing,CBE;Gh BE3),进一步对其中的胞嘧啶脱氨酶r APOBEC1优化改造,以提升CBE在棉花中编辑效率和精确性。本研究在r APOBEC1中引入W90Y和R126E点突变(YE1-r APOBEC1)后构建了新的Gh YE1-BE3-FNLS系统,根据棉花内源基因Gh TFL1启动子序列设计靶标检测其编辑活性。结果显示,Gh YE1-BE3-FNLS在靶位点上可以实现C-to-T编辑,且效率高达49.5%,与Gh BE3相比其编辑效率(最高为30.7%)有所提高。5.为进一步丰富精准编辑系统,基于棉花高活性的Gh ABE8e和优化后的两个胞嘧啶脱氨酶YE1-r APOBEC1,APOBEC3A构建了双碱基编辑器Gh CABE、Gh ACBE、Gh A3A-ABE,并对他们在棉花中的编辑活性进行评价。研究结果表明,Gh A3A-ABE在棉花中对同一等位基因中可实现A和C的同时编辑,且对A位点的编辑效率可达39.2%;Gh ACBE和Gh CABE都产生了分别为A-to-G和T-to-G的一种类型的编辑。6.针对棉花抗成花素Gh TFL1基因的启动子区和基因编码区,设计了高密度sg RNA,基于高活性的Gh ABE8e,实现Gh TFL1基因的定向进化。通过对编辑材料进行表型鉴定,在所创制的突变体中发现Ghtfl1~(L86P)表Crizotinib MW现出果枝缩短,主茎顶端成簇开花,从而形成自封顶的表型。后代表现出更加明显的株高降低,果枝直接着生于主茎的零式果枝表型。Ghtfl1~(K53G+S78G)表现一个果节结两个铃的表型,但仍保持无限生长状态。相对应的后代也表现出果枝缩短,从二式果枝变为一式果枝,且主茎顶端成簇开花的表型。进一步对jin668、Ghtfl1~(L86P)以及本研究创制的Gh TFL1的CRISPR/Cas9敲除材料(Ghtfl1)进行转录组测序和分析,结果表明Ghtfl1~(L86P)和Ghtfl1材料中Gh AP1基因的表达量上调以及Gh14-3-3基因的表达量下调。进一步通过Y2H、LCI以及Bi FC实验证明Gh TFL1突变前和Ghtfl1~(L86P)均能与Gh AP1、Gh14-3-3互作,但Ghtfl1~(L86P)与Gh AP1、Gh14-3-3之间的互作强度降低,说明L86P突变只影响Gh TFL1蛋白的空间构型,没有使蛋白功能完全丧失。此外,在转录组分析中筛选到Gh LSH6在Ghtfl1~(L86P)与Ghtfl1中表现出一致地下调表达。通过Y2H、Bi FC、LCI以及Pull-down实验证明了Gh TFL1与Gh LSH6存在互作关系。同样地,超表达Gh LSH6基因棉花表现出旺盛的营养生长,而敲除Gh LSH6,生长发育不受影响。说明Gh LSH6参与了Gh TFL1介导的促进棉花营养生长过程,但与其它同源蛋白具有功能冗余性。总之,本研究通过碱基编辑定向进化Gh TFL1所筛选出的Ghtfl1~(L86P)和Ghtfl1~(K53G+S78G)突变材料在棉花株型改良和机械化生产中具有重要价值。综上所述,本研究建立和优化了适用于棉花的ABE和CBE多个系统,并利用高效的碱基编辑工具对Gh TFL1进行饱和的碱基突变,从中发掘出控制棉花理想株型新的遗传位点,创制出株高适中、果枝缩短、株型紧凑以及生育期缩短的棉花新种质,实现Gh TFL1基因的快速定向进化,为棉花株型改良和机械化生产提供重要的技术平台和生物育种基础材料。