多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一种中枢神经系统受累为主的炎性脱髓鞘疾病,髓鞘脱失、炎性细胞浸润、轴突变性和神经胶质细胞增生为其主要病理特点。MS病因尚不明确,免疫失衡被认为是其发病机制中至关重要的一环,发病初始抗原提呈细胞错误的将自身抗原如髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白T细胞在外周被异常活化生成自身反应性T细胞,通过破坏的血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)进入中枢神经系统(Central nervous system,CNS),并被自身的神经髓鞘抗原再次激活形成髓鞘特异性自身反应性T细胞,后者将分泌大量的致炎物质、趋化募集更多的炎性细胞,导致炎症级联反应,最终对神经髓鞘或轴突造成严重损伤。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前已知的具有最强抗原提呈能力的专业抗原提呈细胞(Antigen presentation cells,APCs),其在捕获抗原后通过加工处理并分割为不同的多肽后通过其表面的主要组织相容性复合物(MHC)等结构与T细胞表面的受体相互作用,并在多种刺激信号的协同作用下完成对T细胞的激活。DCs对于免疫反应的诱发及调节依赖于其自身的成熟和活化状态。一方面,成熟活化的DCs自身就可以分泌多种炎症因子,例如:IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α等,诱发炎症反应,并且其作为APC不仅对T细胞活化起关键作用,同时对其他类型的免疫细胞也具有调节作用,如B细胞、NK细胞等。另一方面,未成熟或半成熟DCs具有维持免疫耐受抑制炎症反应的作用,其通过低表达共刺激因子,如:CD80、CD86、MHCⅡ,或高表达抑制因子,如PD-L1、Fas L、ICOSL等,抑制反应性T细胞的增殖,诱导T细胞免疫耐受,促进Treg细胞生成,保持炎性环境中的免疫耐受。诱导DCs维持免疫耐受、抑制炎症反应,可通过抗炎细胞因子、基因修饰诱导等途径实现,如IL-10、TGFβ、PD-L1等;但DCs的表型及功能容易受机体内环境的影响,并且即使是同种来源DCs仍然可能导致机体发生排斥反应,此外DCs作为活体细胞储存难度大,因此用于治疗疾病存在很多干扰因素。本研究将从DCs出发通过分析其分泌的免疫抑制因子程序性死亡受体-1(PD-1)/程序性死亡-配体1(PD-L1)及基因修饰后DC产生的外泌体(Exosomes,EXOs)在MS和MS理想的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的作用,探讨其对MS的作用及对EAE的保护作用机制。研究分为以下三部分,具体如下:第一部分复发-缓解型多发性硬化患者缓解期患者血清s PD-1、s PD-L1水平与疾病复发及残疾程度的相关性分析目的:利用单分子阵列分析(Single molecule array,Simoa)技术检测复发-缓解型多发性硬化(RRMS)患者血清中s PD-1及s PD-L1的表达水平,并分析二者在缓解期RRMS患者血清表达水平的相关性及其与病程、疾病复发频率以及残疾程度的相关性。方法:1.纳入RRMS组患者共27例,健康组选取与RRMS患者例数、性别、年龄相匹配的健康志愿者共26例。2.收集患者临床资料,包括:患者性别、年龄、首次发病日期、病程、疾病复发次数(从首次发病到采血时间点的总发作次数),并采用扩展残疾量表(Expanded Disability Status Scale,EDSS)评估患者的神经功能。3.应用Simoa技术检测RRMS患者血清中s PD-1及s PD-L1的表达水平。对血清PD-1、PD-L1水平直接的相关性,以及二者与病程、发作次数、EDSS评分的相关性进行分析。结果:1.两组受试者性别分布、年龄比较,差异均无统计学意义(P=0.766,P=0.159),因此两组具有可比性。2.RRMS组血清s PD-Water microbiological analysis1、s PD-L1水平较健康对照组显著升高(P<0.05)。3.RRMS患者血清s PD-1、s PD-L1水平之间及其与病程、发作次数、EDSS评分相关性分析,结果显示s PD-1与s PD-L1水平呈正相关(P<0.001);RRMS患者血清s PD-1水平与发作次数呈正相关(P=0.030),血清s PD-1与s PD-L1水平与病程、EDSS评分无明显相关性(P>0.05)。小结:RRMS患者血清中s PD-1及s PD-L1的表达水平较健康对照组显著升高,但s PD-1与s PD-L1水平与疾病病程、EDSS评分无明显相关性。第二部分FOXP3基因过表达腺病毒转染未成熟树突状细胞外泌体的提取及鉴定目的:以小鼠FOXP3基因为模板,扩增目的基因,构建FOXP3基因过表达腺病毒;以FOXP3过表达腺病毒转染未成熟树突状细胞(im-DCs),提取培养基中的EXO,进一步对所获得的EXOs进行鉴定、分析,确定FOXP3在EXOs中稳定表达。方法:1.以FOXP3基因为模板,应用PCR技术扩增目的基因后与载体连接,构建质粒。2.应用FOXP3过表达腺病毒转染HEK293细胞,扩增病毒后,纯化病毒,并检测病毒活性及滴度。3.选取清洁级C57BL/6雌鼠,在无菌环境下分离小鼠完整股骨。在股骨两端及中央多处打孔,以RPMI-1640培养液轻柔冲洗股骨的骨髓腔,收集并裂解红细胞后,用RPMI-1640培养液清洗细胞混悬液后离心,调整细胞浓度为1×10~6/ml,接种于六孔板,使用含10%胎牛血清、10ng/ml白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)、10ng/ml粒细胞巨噬细胞刺激因子(gra-nulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的RPMI-1640培养基,培养并观察细胞的形态及生长状态。4.应用德国美天旎磁珠分选系统纯化im DCs,按照感染复数MOI=200的比例以FOXP3过表达腺病毒转染im DCs,24小时后更换培养液,培养液调整为含10%去除EXOs的胎牛血清RPMI-1640的混合培养液,继续培养72小时。培养过程中利用荧光显微镜动态观察im DCs细胞FOXP3的表达情况。5.FOXP3过表达腺病毒转染im DCs 72小时后,收集细胞及培养液,培养液按照比例加入外泌体提取试剂盒混合均匀,室温静置12小时后,离心收集FOXP3过表达转染im DCs来源EXOs(FOXP3-EXOs)。6.电子显微镜观察im DCs及EXOs的形态,应用粒径分析对纯化后的EXOs进行分析;Western-blot法检测FOXP3-EXOs的标志性蛋白及FOXP3在EXOs中的表达。结果:1.腺病毒按照实验步骤纯化后,根据公式计算病毒滴度,测定病毒滴度为:HBAD-m-foxp3-3*flag-EGFP 1.58*10^10 PFU/m L HBAD-m-foxp3-3*flag-EGFP 1.99*10^10 PFU/m L HBAD-EGFP过表达对照1.58*10^10 PFU/m L2.病毒质量检测,细胞培养基澄清透明,细胞间隙无明显颗粒,无细菌或真菌感染。3.FOXP3过表达腺病毒转染im DCs后应用Western Blot技术对转染后im DCs中FOXP3的蛋白表达情况进行检测,结果显示两组细胞中FOX-P3的表达有显著差别(P<0.05)。4.电子显微镜下观察EXOs形态为直径约100nm的圆形或椭圆形囊泡。对所提取的FOXP3-EXOs进行粒径分析,显示囊泡直径约100nm。5.FOXP3-EXOs稳定表达EXOs标志性蛋白CD63、HSP70及FOXP3,Con-EXOs仅表达CD63、HSP70。小结:1.FOXP3过表达腺病毒转染im DCs后,检测到im DCs中FOXP3的稳定表达。2.FOXP3过表达腺病毒转染im DCs后提取EXOs,确定FOXP3-EXOs表达CD63、HSP70的同时,FOXP3也稳定表达。第三部分FOXP3过表达未成熟树突状细胞来源外泌体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的保护机制研究目的:以FOXP3-EXOs干预EAE小鼠,通过体内和体外实验观察小鼠的神经功能评分、脑与脊髓组织的病理改变,血清中炎症因子的水平、脾中T细胞亚型变化及其对CD4~+T细胞增殖情况的影响。方法:1.EAE动物模型的建立:C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、EAE组、Con-EXOs治疗组、FOXP3-EXOs治疗组。对EAE组、Con-EXOs治疗组、FOXP3-EXOs治疗组小鼠进行免疫。用生理盐水将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG)35-55多肽稀释,配制为10mg/ml的溶液。加入等体积的完全弗氏佐剂,并加入结核杆菌H37Ra使其浓度达到4mg/ml。充分乳化混合液,直至形成油包水状态的乳剂,在小鼠背部脊柱两侧均匀分布的四点进行皮下注射,每只0.1ml。随后分别在免疫第0h及第48h给予小鼠0.5ml百日咳毒素腹腔注射。2.免疫后的第3、6、9、12、1selleck抑制剂5天对各组小鼠分别以生理盐水、Con-EXOs、FOXP3-EXOs通过尾静脉注射进行干预。免疫小鼠后,每日使用Weaver’s法(15分法)对四组小鼠进行神经功能评分并称量体重,连续观察至免疫后第23天。3.应用HE染色观察小鼠脊髓炎性细胞浸润情况,应用LFB染色观察髓鞘脱失情况。4.应用CCK8试剂盒检测FOXP3-EXOs与Con-EXOs对C57BLZ945抑制剂BL/6小鼠脾脏CD4~+T淋巴细胞增殖的影响,ELISA法测定FOXP3-EXOs对小鼠CD4~+T细胞培养上清中炎症因子(IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17)的水平变化。5.应用流式细胞学检测各组小鼠脾脏中Th1、Th2、Th17和Treg细胞的比例。6.应用ELISA方法检测干预组及对照组EAE小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17、IL-10的水平。结果:1.FOXP3-EXOs减轻EAE的神经功能损伤,推迟起病时间,并可以改善EAE小鼠发病后出现的体重减轻的状况。2.与对照组相比,FOXP3-EXOs干预后,小鼠脊髓炎性细胞浸润程度减轻,神经髓鞘脱失程度减轻。3.FOXP3-EXOs与对照组及Con-EXOs相比能够显著降低EAE小鼠Th1、Th17细胞的水平,升高Treg细胞水平。4.FOXP3-EXOs与对照组及Con-EXOs相比EAE小鼠血清中IFN-γ、IL-6和IL-17的水平明显降低,IL-10水平升高。5.FOXP3-EXOs显著抑制CD4+T细胞增殖,且呈剂量依赖性;而Con-EXOs组则无明显抑制作用。同时发现FOXP3-EXOs能够显著抑制CD4+T细胞INF-γ、IL-6和IL-17的分泌,促进IL-10的生成。小结:1.FOXP3-EXOs在EAE体外和体内均能抑制Th1和Th17细胞的产生,促进Treg细胞的分化,改善EAE的病理过程。2.FOXP3-EXOs对EAE的神经保护作用可能是通过调节Th/Treg细胞的平衡实现。