类黄酮是柑橘中最为重要的功能性成分之一,尤其以橙皮苷等黄烷酮含量最为丰富。橙皮苷是苯环上连接一个-OCH_3的黄烷酮糖苷化合物,其不仅在防御动物和抵抗微生物侵扰中起重要作用,还具有广谱药理活性,抗癌谱较广。但柑橘中橙皮苷生物合成相关的C4’位O-甲基转移酶(4’OMT)基因尚未明晰,值得深入研究。本研究在对91份不同柑橘种质中橙皮苷含量进行分析的基础上,通过正向遗传学方法对人工杂交群体进行主效QTL定位并结合转录组数据鉴定与橙皮苷生物合成相关的关键4’OMT基因,而后通过酵母获悉更多异源表达和柑橘本体瞬时注射验证关键候选4’OMT对橙皮苷生物合成的功能。主要研究结果如下:1.橙皮苷生物合成有种质特异性通过分析4类柑橘品种不同组织橙皮苷含量,揭示橙皮苷积累的组织特异性。进一步定量分析4个宽皮柑橘品种(Citrus reticulata)和2个甜橙品种(C.sinensis)果实发育期黄皮层橙皮苷含量变化,发现宽皮柑橘60-150 DPA果实积累的橙皮苷较高,甜橙则在40-60购买IACS-010759 DPA达到最高水平,从而明确柑橘橙皮苷生物合成研究的关键时期。继而对67份种质60 DPA、49份210 DPA果实黄皮层,以及75份叶片进行综合分析,发现橙皮苷生物合Molecular genetic analysis成的种质特异性:于宽皮柑橘、甜橙、橘柚、(?)檬与柠檬中高积累,于酸橙、葡萄柚、香橙、枸橼和枳橙中少量积累,而在柚、枳柚、枳、莽山野柑和蚝壳刺中不积累。叶片中橙皮苷丰度水平远低于果实黄皮层。2.橙皮苷合成的主效QTL定位基于红橘(C.reticulata,积累橙皮苷)×枳(Poncirus trifoliata,不积累橙皮苷)F_1人工杂交群体高密度遗传图谱,通过正向遗传学技术对杂交子代的橙皮苷积累性状进行主效QTL定位。以克里曼丁橘为参考基因组,定位到scaffold3和scaffold 9两个候选区间,分别注释鉴定出11个和5个OMTs基因,其中Ciclev10005251m(CreOMT13)与1,6-鼠李糖基转移酶基因(1,6Rha T)(Ciclev10004868m)距离最近,仅0.942 Mb,二者可能存在基因共表达现象,催化橙皮苷的合成。结合6种柑橘种质转录组数据,对上述16个OMTs基因进行表达量分析,发现仅CreOMT13在高积累橙皮苷的种质高表达,在不积累橙皮苷的种质表达量很低或不表达,具有显著相关性。因此将CreOMT13作为关键4’OMT候选基因。后续通过RT-qPCR分析其在67份种质60 DPA果实黄皮层的表达水平,发现该基因表达量与橙皮苷的积累量呈现较为一致的趋势。3.利用酵母真核表达和柑橘本体基因瞬时超表达体系验证CreOMT13功能从红橘果实黄皮层中克隆得到CreOMT13全长CDS序列,经酵母底物饲喂发现其能催化柚皮素4’位生成异野樱素,合成橙皮苷的前体物质之一。随后在红橘果实进行CreOMT13瞬时超量表达实验,发现橙皮苷含量显著增加,同时,8种聚甲氧基黄酮(PMFs)含量均显著降低,表明CreOMT13可能竞争PMFs支路的底物。本研究验证了关键4’OMT候选基因CreOMT13在橙皮苷生物合成中的功能,为定向培育整果富集橙皮苷型功能柑橘育种和从头合成橙皮苷的代谢通路构建提供理论依据。