目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是痴呆症最常见的病因,是一种无法治愈的退化性脑部疾病。铁是大脑中最丰富的过渡金属,参与线粒体能量转导、酶催化、线粒体功能、髓鞘形成、神经递质合成和分解代谢。铁的失调与AD以及其他主要神经退行性疾病的发病机制密切相关。Slc11a2基因是溶质载体家族probiotic Lactobacillus(solute carrier,SLC)11的成员,其主要作用是维持铁的稳态。Slc11a2基因是在全身组织细胞内广泛表达的金属-铁转运基因,该基因转录翻译后生成二价金属离子转运蛋白1(Divalentmetal trABT-199供应商ansporter 1,DMT1),参与AD的病理过程。本研究主要关注以下两个问题:1.Slc11a2基因表达量的改变与AD引起的认知功能的障碍是否相关。2.Slc11a2基因能否通过影响Ca MK II信号通路,从而影响细胞铁死亡参与AD病理过程。方法:第一部分:利用同源重组原理,采用受精卵同源重组的方式,对Slc11a2基因进行flox修饰,该flox小鼠与Camk II-Cre的小鼠进行繁育,获得脑内条件性敲除神经元Slc11a2基因小鼠(Slc11a2 ~(flox/flox);Camk II-Cre~+),记为c KO小鼠。对照组为同窝野生型小鼠(Slc11a2 ~(flox/flox);Camk II-Cre~-),记为WT小鼠。利用Aβ_(1-42)寡聚体(Aβ_(1-42)oligomer,Aβo)制作AD模型。实验分为以下四组:WT组、Aβo组、Slc11a2基因条件性敲除组(Slc11a2 c KO)以及Slc11a2基因条件性敲除+Aβo组(Slc11a2 c KO+Aβo)。应用免疫荧光染色观察Aβ斑块沉积和MAP2的表达情况,尼氏染色法检测神经细胞的结构与数量,TUNEL法检测细胞的凋亡情况,利用线粒体ATP检测试剂盒检测线粒体ATP的含量以及蛋白免疫印迹实验检测SYN1、VAMP2、Glu A2、DRP1、UQCRFS1、ATP5H、NMDAR2A和NMDAR2B的水平,采用Morris水迷宫测试检测小鼠的认知能力。第二部分:在京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)在线数据库检索“阿尔茨海默病”与“铁死亡”信号并获取通路编号,使用Gene expression omnibus(GEO)在线数据库中进行验证。动物实验分组同前;细胞实验采用的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,分为Control组、Aβo组、Slc11a2-si RNA组、Slc11a2-si RNA+Aβo组以及在此基础上给予铁死亡激活剂(RSL3)组。采用蛋白免疫印迹实验检测SLC7A11、GPX4、FSP1、Tf R1、ferritin、FPN1、hepcidin的水平,铁定量检测试剂盒检测铁的水平,采用流式细胞术法对各组SH-SY5Y细胞的凋亡情况进行了检测。第三Taurine供应商部分:动物实验分组同前;细胞实验分为Control组、Aβo组、Slc11a2-si RNA组、Slc11a2-si RNA+Aβo组以及在此基础上给予Ca MK II抑制剂(KN-93)组。蛋白免疫印迹实验检测p-Ca MKII、p-CREB、Ca MKII、CREB、SLC7A11、GPX4、FSP1、SYN1、VAMP2、Glu A2、MAP2的水平,采用流式细胞术法对各组SH-SY5Y细胞的凋亡情况进行了检测,铁定量检测试剂盒检测铁的水平。结果:第一部分:1.条件性敲除神经元Slc11a2转基因小鼠构建成功,通过繁育和基因型鉴定获得稳定的Slc11a2 ~(flox/flox);Camk II-Cre~+基因小鼠。2.Slc11a2 c KO+Aβo小鼠颞叶皮层中异常的神经细胞数量和Aβ沉积均较Aβo小鼠减少。Slc11a2 c KO+Aβo组中可见神经细胞的形态基本正常,呈圆形和锥体形,排列整齐,胞膜和核仁清晰,尼氏体密集,可见少量聚集的Aβ阳性染色。而在Aβo组小鼠的颞叶皮层区神经细胞缩小或脱失,细胞间边界模糊且排列较稀疏,部分细胞出现了核固缩或溶解,尼氏体明显减少,有大量的聚集的Aβ阳性染色区域。神经细胞计数显示Slc11a2c KO+Aβo组颞叶皮层神经细胞的数量显著高于Aβo组(P<0.0001)。Aβo组和Slc11a2c KO+Aβo组小鼠颞叶皮层中凋亡的神经细胞显著增多,但Slc11a2 c KO+Aβo组凋亡细胞数量低于Aβo组(P<0.01)。3.敲除Slc11a2基因能够改善神经元功能、缓解线粒体损伤。Aβo小鼠颞叶皮层中SYN1、VAMP2、Glu A2、NMDAR2A、NMDAR2B、UQCRFS1、ATP5H的表达和MAP2的荧光强度以及ATP水平显著低于WT对照组,而Slc11a2 c KO+Aβo组上述蛋白和ATP水平显著高于Aβo组(P<0.05),DRP1蛋白的表达则相反(P<0.0001)。4.Slc11a2基因敲除能够逆转Aβo造成小鼠的认知功能障碍。与WT对照组相比,Aβo组的逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数和目标象限时间出现缩短,而Slc11a2 c KO+Aβo组逃避潜伏期与Aβo小鼠相比有一定程度缩短,穿越平台次数和目标象限时间则有所增加(P<0.05)。第二部分:1.在KEGG数据库检索铁死亡和阿尔茨海默信号通路相关基因交集可获得Slc11a2基因,进行验证后发现Slc11a2基因为差异基因(P<0.01)。2.动物实验中,Aβo可引起铁在颞叶皮层中含量升高,而Slc11a2基因的敲除能够降低铁在AD模型小鼠大脑颞叶皮层中的沉积,与Aβo组相比,铁的含量明显下降(P<0.01);Slc11a2基因的敲除能影响AD模型铁死亡蛋白和铁转运相关蛋白的水平,在Slc11a2 c KO+Aβo组中SLC7A11、GPX4、FSP1、FPN1和hepcidin的水平明显高于Aβo组,Tf R1、ferritin的含量出现下降(P<0.05)。3.细胞实验中,Slc11a2-si RNA+Aβo组SH-SY5Y的凋亡数量、铁的含量明显低于Aβo组(P<0.001)。敲除Slc11a2基因还能影响Aβo诱导的铁死亡蛋白和铁转运相关蛋白的水平,结果显示Slc11a2-si RNA+Aβo组中SLC7A11、GPX4、FSP1、FPN1和hepcidin的水平明显高于Aβo组(P<0.001),而Tf R1、ferritin的含量则低于Aβo组(P<0.0001),这种变化可被铁死亡激活剂RSL3逆转(P<0.01)。第三部分:1.敲除Slc11a2基因能够逆转AD模型小鼠颞叶皮层中Ca MKII/CREB信号通路活性降低。与WT组相比,Aβo组p-Ca MKII、p-CREB、Ca MKII和CREB的蛋白水平显著降低,而Slc11a2 c KO+Aβo组上述蛋白水平有所恢复(P<0.05)。2.抑制Ca MKII活性能逆转上述Slc11a2基因敲除的保护作用。Aβo组凋亡细胞的数量、细胞内铁含量明显高于Control组,而Slc11a2-si RNA+Aβo组凋亡细胞的数量、铁含量显著下降(P<0.0001),但在使用Ca MKII抑制剂KN-93后,SH-SY5Y细胞的凋亡和含铁量明显再次上升(P<0.0001)。与对照组相比,加入Aβo后,SH-SY5Y细胞SLC7A11、GPX4、FSP1以及SYN1、VAMP2、MAP2、Glu A2的水平显著降低,而Slc11a2-si RNA+Aβo组中上述蛋白水平则明显高于Aβo组(P<0.0001);但是在加入KN-93抑制Ca MKII活性后,SLC7A11、GPX4和FSP1以及SYN1、VAMP2、MAP2、Glu A2的蛋白水平则显著降低(P<0.0001)。结论:1.敲除Slc11a2基因能够帮助小鼠抵抗Aβo造成的神经细胞损伤,促进中枢神经系统能量代谢恢复,改善小鼠行为和认知能力异常。2.敲除Slc11a2基因通过稳定铁代谢和恢复铁稳态,保证钙离子正常转运,从而恢复Ca MKII活性,抑制神经元发生铁死亡,从而减轻Aβo引起的认知功能障碍。