背景高血压是一个严重的全球公共卫生问题,由于高血压引起的脑卒中、认知功能障碍、心力衰竭及肾功能不全等,常常给患者个人和家庭带来沉重负担,已经成为严重影响人类健康的重要疾病。目前市场上治疗高血压的药物比较丰富,但是这些单靶标抗高血压药物只能调节某一个方面,使血压控制效果不理想,增加剂量几乎不能额外降低血压,反而会有增加不良反应的风险。当前高血压的药物治疗策略强调多机制联合治疗,因此开发多靶标抗高血压药物是很有必要的。MT-1207(代号,简称MT)正是瞄准该目标开发的一种新型单分子、多靶标抗高血压药物。目的本实验旨在探索MT-1207的药理学特性,并对其降血压作用机制进行初步研究。方法1、MT-1207的降血压和器官保护作用研究选用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和两肾一夹(two-kidney one-clip,2K1C)高血压犬进行血压监测,观察MT-1207单次给药和多次给药对动物血压、心率和心电图等的影响。随后在SHR和易卒中自发性高血压大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rat,SHR-SP)上进行长期给药,观察MT-1207对SHR血压、动脉压力反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)和器官形态学的影响,以及是否能延长SHR-SP的生存时间。2、MT-1207对双侧肾动脉狭窄模型的影响以内径0.3 mm、0.25 mm和0.2 mm的U型银夹对大鼠行两肾两夹(two-kidney two-clip,2K2C)手术,造成不同程度的双侧肾动脉狭窄,观察急性血压变化情况,并在手术之后2周、4周和6周检测大鼠的血压、肾功能及器官形态学。选择0.2 mm内径作为2K2C大鼠的造模标准,观察MT-1207长期给药对2K2C模型大鼠的血压、肾功能、认知功能、心功能、器官形态学以及生存曲线的影响。3、MT-1207对血糖、血脂和动脉粥样硬化的影响给予C57BL/6小鼠MT-1207灌胃,时间4周,每周检测小鼠的血糖水平,给药结束后采血检测血脂水平。给予6～8月龄载脂蛋白E敲除(apolipoprotein E~(-/-),Apo E~(-/-))小鼠MT-1207药物饲料喂养,期间每4周检查一次血糖水平,4个月后检查小鼠的血脂水平和动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块形成情况。4、MT-1207的作用机制研究在离体血管环张力实验中,应用肾上腺素、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、KCl和5-HT预收缩血管环,然后给予MT-1207,观察MT-1207能否舒张预收缩的离体血管环。在离体心脏实验中,摘取豚鼠心脏,并通过给予营养液、O_2等条件,维持其体外跳动,然后给予MT-1207观察其对心率的影响。在分子靶标结合抑制研究中,检测1μM MT-1207对87个与血压调控相关分子靶标的结合抑制能力,并将1μM下作用≥50%的分子靶标进行二次筛选。二次筛选时使用5种浓度(0.1 n M、1 n M、10 n M、0.1μM、1μM)的MT-1207来测量与靶分子的剂量-效应关系及IC_(50)。在细胞收缩实验中,观察MT-1207预给药后能否抑制苯肾上腺素或5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的收缩反应,验证筛选出的分子靶标是否正确。MT-1207与5-HT_(2 A)受体结合模式研究中,应用GOLD 5.0软件进行MT-1207与5-BAY 73-4506HT_(2 A)受体的对接模拟,选择最佳构象分析配体-蛋白质的相互作用。结果1、MT-1207的降血压和器官保护作用研究MT-1207单次口服给药能够有效降低SHR和2K1C犬的血压水平,最大降压效果时间在2 h内,维持时间为8～10 h,MT-1207还具有起效迅速、轻度减慢心率的特点。MT-1207连续给药7天发现,其对SHR和2K1C犬的降血压效果确切,对心电图没有影响。MT-1207连续给药4个月发现,SHR在给药期间能够平稳降压,并且能够改善BRS,有助于血压维持平稳。组织形态学分析,MT-1207对大鼠的肾脏具有保护作用。在SHR-SP生存观察实验中,近8个月时,对照组大鼠全部死亡,而MT-1207组还有50%的动物存活,提示MT-1207可以延迟SHR-SP的卒中发生和提高生存率。2、MT-1207对双侧肾动脉狭窄动物模型的影响2K2C手术可以造成大鼠的肾血管性高血压,动物在手术清醒后,立刻引起SBP升高,并维持在较高的水平。在手术后2周、4周和6周时检测发现,SBP在2周时仍在逐渐升高,4周时达到平台水平,并且SBP与血管狭窄程度呈正相关。血清肾功能检查发现,仅0.2 mm银夹可以显著升高大鼠的血清肌酐和尿素水平。组织形态学检查发现,大鼠在2K2C手术后2周时就已经出现明显的器官损伤。MT-1207能够显著降低2K2C大鼠的血压水平;在肾功能方面,MT-1207没有加剧肾功能损伤,对血清肌酐、尿素和K~+水平没有影响,并能够轻度降低尿酸水平;在认知功能方面,MT-1207能够改善大鼠的学习记忆能力;在心功能实验中,MT-1207能够显著降低2K2C大鼠由高血压引起的超负荷,增加心肌的顺应性,改善心脏功能;MT-1207还能够降低心肌寻找更多和主动脉肥厚,对肾脏也有保护作用;MT-1207可以显著延长2K2C大鼠的生存时间。3、MT-1207对血糖、血脂和动脉粥样硬化的影响MT-1207灌胃给药4周对高脂饮食C57BL/6小鼠血糖、血脂没有降低作用。在Apo E~(-/-)小鼠上给予MT-1207latent TB infection药物饲料喂养,也没有发现MT-1207有降低血糖、血脂和AS斑块面积的作用。4、MT-1207的作用机制研究MT-1207能够浓度依赖性舒张由肾上腺素、NE、KCl和5-HT预收缩的大鼠离体胸主动脉环,表明MT-1207的抗高血压作用至少通过其对血管的直接作用。MT-1207能够浓度依赖性地降低离体心脏的心率。MT-1207对α_(1 A)、α_(1 B)、α_(1 D)和5-HT_(2 A)受体有非常高的结合抑制活性,表明MT-1207可以通过阻断以上受体发挥降血压和减慢心率的作用。MT-1207能够拮抗由苯肾上腺素和5-HT引起的血管平滑肌细胞收缩反应,从功能上验证了上述分子靶标筛选结果的正确性。通过计算机分子模型研究,模拟MT-1207与5-HT_(2 A)受体的合理结合模式,即MT-1207的苯并三唑部分与5-HT_(2 A)受体的Phe340和Trp336形成π-π堆积作用,噻唑基和哌嗪基与周围残基之间形成疏水相互作用。结论1、MT-1207具有明确的抗高血压和器官保护作用,具有起效快、轻度减慢心率的特点,对心脏传导系统没有影响,能够延长易卒中自发性高血压大鼠的生存时间。2、MT-1207能够降低2K2C大鼠的血压,对肾功能没有恶化作用,并能够轻度降低尿酸水平,对认知功能、心功能、器官形态学以及生存率均有改善作用。3、MT-1207没有降低血糖、血脂和动脉粥样硬化斑块面积的作用。4、MT-1207具有直接舒张血管和降低心率作用,是通过拮抗肾上腺素能α_(1A)、α_(1B)、α_(1D)和5-HT_(2A)受体发挥降低血压和减慢心率的作用。分子模型模拟研究发现,MT-1207的苯并三唑部分与5-HT_(2A)受体的Phe340和Trp336形成π-π堆积作用,噻唑基和哌嗪基与周围残基之间形成疏水相互作用。