第一部分成骨不全症儿童的心血管异常表现及IACS-10759其与基因型的关系[研究背景和目的]成骨不全症(Osteogenesis imperfecta,OI)是一种以骨骼脆性增加、Ⅰ型胶原合成及代谢紊乱为核心的遗传性结缔组织疾病。Ⅰ型胶原是全身结缔组织的重要成分,广泛分布于多多种脏器与组织,也因此,OI可出现多种骨骼外表型,如蓝巩膜、听力下降、关节韧带松弛、牙本质发育不全、心脏瓣膜病变等。OI是一种致病基因谱及临床表型谱有较大异质性的复杂疾病。既往研究多集中于骨骼表型,但骨骼外表型同样影响OI患者生活质量,其中呼吸循环系统相关并发症可能影响OI患者的寿命。成人OI发生心血管疾病的风险较普通人群增加。既往对OI患者特别是OI儿童的心血管表型评估并不充分,OI基因型-心血管表型的关系尚不清楚。因此本研究旨在通过超声心动图及心电图,评估OI儿童的心血管改变,并分析其与基因型的关系。[方法]本研究为一项横断面病例对照研究,纳入2017年1月至2022年1月于北京协和医院内分泌科诊断为OI的儿童,并按体表面积(Body surface area,BSA)匹配健康对照儿童。由有经验的心内科医师应用超声心动仪完成超声心动检查,评估心脏结构及功能。采用心电图仪采集OI患者静息状态下的12导联心电图(Electrocardiogram,ECG)。临床表型评估包括身高、体重、骨折、骨骼畸形、活动状态、骨骼外表型等。应用双能X线骨密度仪测量OI患者骨密度,行胸腰椎正侧位片评估脊柱侧弯及椎体压缩性骨折情况。通过二代靶向测序技术,检测OI患者致病基因突变,并进行Sanger测序验证。比较OI患儿与BSA匹配的健康儿童,以及不同临床分型及基因型OI患者间的超声心动图差异。校正年龄、BSA及性别等影响因素后,将OI基因型与超声心动图各指标行相关性分析,探索OI儿童心血管表型与基因型的关系。[结果]纳入69例OI患儿及42名BSA匹配的健康儿童,共在6例OI儿童中发现超声心动图的异常,包括左心房扩大(n=5)、左心室内径扩大(n=1),且这些患儿的基因型均为COL1A1突变。26例OI儿童检出轻度二尖瓣或三尖瓣返流。在8例OI患儿中检测到异常心电图表现,包括Q波加深、T波改变、室性期前收缩、短P-R间期、不完全性束支传导阻滞及左室高电压。与健康儿童相比,O1 儿童的主肺动脉(Main pulmonary artery,MPA)内径(1.84 vs 1.60cm,P<0.001)、左心房内径(Left atrialdiameter,LAD)(2.58 vs2.11cm,P<0.001)及左心室舒张末期内径(Left ventricular internal dimension at end-diastolic,LVEDd)(3.85 vs 3.50cm,P<0.01)均显著增大购买Tamoxifen,且左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)下降(68.40vs71.74%,P<0.01)。相较于健康儿童,COL1A1突变的OI患者更容易出现左心房(P<0.001)、左心室(P<0.05)和主肺动脉内径扩大(P<0.01),及左室射血分数下降(P<0.01)。无论是在COL1A1基因突变导致I型胶原数量减少或结构变异的患儿中,均可能存在心血管系统的改变,COL1A1基因突变与 MAP 内径增加(β=1.557,P<0.01)、LAD 扩大(β=3.915,P<0.001)、LVEDd 增大(β=2.714,P<0.01)及 LVEF 下降(β=-3.249,P<0.01)等超声心动图改变独立相关。[结论]OI患儿较健康对照容易出现心血管异常,包括主肺动脉及左心房室内径增宽、左室射血分数下降,提示应关注OI患者的心血管系统表现。OI患儿的心血管表型改变可能与COL1A1基因突变及Ⅰ型胶原缺陷相关。本研究加深了对OI患者心血管表型的认识,揭示Ⅰ型胶原异常可累及骨外组织器官,应对OI患者的心血管改变予以关注。第二部分Pls3突变相关早发性骨质疏松大鼠模型的心血管表型及其与胶原合成及代谢关系的研究[研究背景和目的]研究表明,OI的致病基因已有24种,涉及多条重要信号通路,参与胶原合成及代谢,其中85-90%的基因以显性遗传方式遗传,余下10-15%为隐性遗传方式。丝束蛋白3(Plastin3,PLS3)是一种调控肌动蛋白集束,与多种细胞活动、信号通路及疾病相关的重要蛋白。PLS3的编码基因PLS3突变可引起X染色体伴性遗传的早发性骨质疏松症,是OI的罕见致病基因之一,其与Ⅰ型胶原代谢通路的关系尚不清楚。既往有PLS3突变的OI患儿合并先天性动脉导管未闭(Patent ductus arteriosus,PDA)的病例报道。既往少有研究探索罕见OI致病基因PLS3突变动物模型的心血管表型。本研究以课题组前期自主建立的Pls3大片段基因敲除的新型OI大鼠模型为基础,评估其心血管表型及心血管组织内胶原合成及代谢情况。[方法]利用课题组前期通过CRISPR/Cas9技术构建的Pls3基因大片段敲除的大鼠模型(Pls3E10-16del/0),取6-8周龄大鼠,通过免疫组织化学染色,鉴定Pls3蛋白在大鼠心血管组织中的表达情况,及Pls3敲除后蛋白表达的变化。对Pls3E10-16del/0大鼠进行心血管表型评估,超声心动评估其心血管形态及功能,HE染色切片了解其心脏及心肌细胞情况,利用血小板内皮黏附因子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)免疫荧光染色评价血管内皮细胞改变。为评估Pls3E10-16del/0大鼠心脏及大血管组织中的胶原表达及结构,采用Masson染色观察并统计其心血管组织中胶原表达及分布,使用扫描电镜评估胶原微结构及排列。并通过实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymeHCV hepatitis C virusrase chain reaction,qRT-PCR)检测Pls3E10-16del/0大鼠较野生型,肌动蛋白及胶原合成相关基因的表达水平是否有改变,以探索Pls3突变与胶原合成及代谢的关系。[结果]本研究发现,Pls3在野生型大鼠心血管组织的细胞质内广泛表达,且Pls3敲除后心血管组织内的Pls3表达受到影响。心血管表型方面,Pls3E10-16del/0大鼠的心脏及大血管未见显著结构与功能异常,但与野生型大鼠相比,有右心室舒张末内径及近端升主动脉内径的缩小,血管内皮细胞减少及排列紊乱。胶原表达与结构方面,Pls3E10-16del/0大鼠心血管组织中的胶原合成未受影响,但其心脏及升主动脉中均观察到细胶原纤维断裂、排列散乱的现象。此外,Pls3E10-16del0大鼠的肌动蛋白合成基因Acta2,与胶原合成及代谢相关通路有关的重要基因Colla1、Col3a1、Tgfβ、Smad2 及Smad3的表达量较野生型大鼠无明显差异。[结论]本研究首次对新型早发性骨质疏松大鼠模型——Pls3基因大片段敲除大鼠的心血管系统进行评估,发现存在右心室及升主动脉内径缩小、血管内皮细胞减少及细胶原纤维断裂、排列散乱等表现,但未见显著的心血管结构与功能异常。提示OI罕见基因型Pls3基因突变可能影响血管内皮细胞,但其与胶原合成及代谢的关系仍有待研究进一步探索。本研究拓展了对OI罕见基因型大鼠心血管表型的认识。