第一部分:常染色体隐性遗传病Schwachman-Diamond综合征家系致病基因鉴定研究背景:Schwachman-Diamond综合征(SDS)是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病,属于先天性骨髓衰竭疾病的一类,常见于儿童,临床主要以胰腺外分泌功Rapamycin能不全、先天性躯体畸形(主要是长骨干骺端发育异常)及骨髓造血衰竭为特征,成年后发展为骨髓增生异常综合征/急性髓系白血病(MDS/AML)的风险极高,也是患者成年死亡的主要原因。SDS最显著相关的突变基因为Schwachman-Bodian-Diamond基因(SBDS),位于染色体7q11,临床90%以上的患者存在本基因的突变。SBDS蛋白在核糖体合成及纺锤体稳定方面起重要作用,此外还参与细胞应激反应、细胞趋化及细胞凋亡等功能,因此SDS被认为主要是一个核糖体合成缺陷性疾病。除了 SBDS基因突变导致可导致本病的发生,事实上,临床仍有10%左右的病人没有出现SBDS突变。目前研究的比较清楚的三个基因分别为EFL1(Elongation Factor Like GTPase 1)、DNAJC21(DnaJ heat shock protein family(Hsp40)member C21)与 SRP54(Signal recognition particle 54)。EFL1编码的EFL1蛋白主要存在于细胞质中,参与60S核糖体亚基的生物发生和核糖体的翻译激活,它与SBDS蛋白一起,触发细胞质中pre-60S 前核糖体对 EIF6(Eukaryotic Translation Initiation Factor 6)的 GTP 依赖性释放,从而通过允许80S核糖体组装来激活核糖体的翻译能力,并促进EIF6再循环到细胞核,在核内EIF6是60S rRNA加工和核输出所需的。具有低的内在GTP酶活性,其GTP酶活性通过与60S核糖体亚基接触而增加。DNAJC21是编码热休克蛋白家族成员的基因,与SBDS相似,DNAJC21蛋白参与了 pre-60S从核内向胞质中的转移与成熟,完成后离开pre-60S,如果基因发生突变导致蛋白不发能与pre-60S解离,会导致pre-60S无法成熟,进而无法装配成有蛋白合成功能的80S核糖体。SRPs是核糖体蛋白复合物,介导新生信号序列携带的多肽靶向定位到内质网表面的易位子(translocon)上,若该基因发生突变,则会导致蛋白质无法到达内质网,影响蛋白质的合成。以前的研究认为肌细胞增强因子2(myocyte Enhancer Factor 2,MEF2)蛋白家族的作用在于心脏和肌肉发育。最近的报告表明,它们也与许多人类疾病的发生和发展密切相关。MEF2转录因子在生理和病理过程中起着至关重要的作用。MEF2家族成员主要参与神经发育、肌肉形成,心脏发育,与肿瘤癌变。虽然它们在癌症生物学中的作用已经确立,但其作用的分子机制还不清楚。越来越多的证据表明,MEF2家族基因突变或异常表达有助于人类各种疾病的发展。例如在本研究相关的血液病领域,MEF2B、MEF2C和MEF2D突变导致恶性血液病都在既往有过报道,其中MEF2C与造血系统的功能研究被阐述的最为详细,研究发现MEF2C与Notch信号通路相关,而Notch是造血细胞分化发育的重要信号通路,因此MEF2C与造血细胞发育有重要相关性。此外还有研究显示MEF2C异常表达与AML的预后有一定关系。MEF2A是家族基因中,唯一没有被报道过与血液系统疾病有关的基因,该基因既往更多的研究主要集中在心血管和肌肉病领域。但是从进化的角度来看,MEF2A和MEF2C是最相近的,MEF2B是整个家族中最远的。体现在基因结构上MEF2A和MEF2C也是最相似的。因此我们有理由推测,MEF2A在血液系统中应该和MEF2C具有相似的作用,而MEF2C在血液系统中的功能研究已经较为丰富,因此我们筛选的MEF2A应该具有一定的合理性。全外显子测序(Whole-exome sequencing,WES)是便宜、快捷、应用频率最高的基因组测序方法。外显子是负责人基因组蛋白编码的区域,利用DNA捕获技术可以将目的序列DNA捕获并富集。虽然外显子区域仅占全基因组的1%左右,它却包含了 85%的致病突变基因。外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的变异。结合大量公共数据库提供的外显子数据,可以让我们更好地解释基因突变与疾病的关系。集落形成单位(Colony-forming unit,CFU)试验,也称为集落形成细胞(colony forming cell,CFC)试验,是造血祖细胞最常用的体外分化测定试验。CFU测定是通过在半固体(通常以甲基纤维素为基础)培养基中,添加适当细胞因子,以低细胞密度沉积单细胞悬液进行的。这些条件支持个体祖细胞的增殖和分化,从而形成离散的集落。来自不同类型祖细胞的集落可根据它们所包含的成熟细胞的数量和类型,使用形态学和表型标准进行分类与计数。CFU检测最常用来检测红细胞系、粒细胞系和巨噬细胞系的多潜能祖细胞,巨核细胞和B淋巴祖细胞也可以检测。虽然纯化的造血干细胞在适当的培养条件下可以形成集落,但在骨髓、血液和其他组织中检测到的CFU大多数是有自我更新受限、体内造血再繁殖潜力受限的祖细胞。然而,在长期移植试验过于昂贵或不切实际的情况下,CFU试验可以作为一种有用的观察体外造血干细胞分化替代试验。条件性基因敲除(conditional knock-out)小鼠(也叫Flox小鼠)是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠,与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。重组酶系统(如:Cre-loxP)介导的位点特异性重组技术。Cre是重组酶(38kDa),可识别34bp长的DNA序列loxP。loxP两侧各13bp构成回文结构,中间8bp为非回文结构,因此loxp具有方向性(当DNA分子上存在两个同向loxP序列时,Cre可将两个loxP序列之间的DNA片段切出并环化,同时将loxP两侧的序列进行连接;当DNA分子上存在两个方向相反的loxP序列时,Cre可导致loxP之间的序列发生反转。)。条件性Biochemistry and Proteomic Services基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre重组酶识别的loxP序列,这种基因称为floxed gene。带有floxed靶基因的小鼠称为flox小鼠。在这种小鼠中,通常采用DNA同源重组方法,在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP位点。loxP位点的存在应不影响该基因的功能,故选择对照为flox/flox小鼠。除了 flox小鼠以外,重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre工具鼠。Cre工具鼠中,将Cre重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下,Cre的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。Cre在哪一种组织细胞中表达,靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞;Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率;使用诱导型Cre重组酶可以通过给予诱导剂,决定在特定的发育时期或Q-VD-Oph疾病发生阶段,定时地进行基因敲除。研究目的:1.利用全外显子测序技术和Sanger测序反向验证,探究患者家系致病基因;2.对筛选出的基因做功能实验验证分析,解释临床患者所患疾病的发病机制。研究方法:1.收集家系骨髓样本,每例约3mL;2.分离骨髓单个核细胞;3.提取单个核细胞DNA;4.全外显子测序;5.测序数据清洗、过滤、筛选出候选基因;6.加入家系另外人的DNA,Sanger测序验证候选基因,进一步缩小范围;7.确定研究基因;8.查阅待研究基因相关资料;9.分离脐血中造血干祖细胞;10.包被慢病毒,用慢病毒感染造血干祖细胞;11.培养后分选GFP阳性的细胞,体外进行CFU实验;12.培养2周后统计集落大小和数量,并做统计学分析;13.使用C57BL/6J和Vav-Cre小鼠构建条件敲除MEF2A基因小鼠;14.验证小鼠构建是否成功;15.检测小鼠血液系统成分及数量变化。研究结果:1.患者的临床表现和病史、家族史均符合Schwachman-Diamond综合征,根据现有诊断共识,可以临床诊断为Schwachman-Diamond综合征。接下来需要对该病人进行分子生物学诊断;2.对患者家系骨髓中的单个核细胞做全外显子测序,经数据过滤、清洗及筛选后,共有159个SNP及85个INDEL候选突变位点,分别是有118个SNP遵循复合杂合遗传模式,有38个INDEL突变遵循常染色体显性遗传模式,有22个SNP突变遵循常染色体显性遗传模式,有47个INDEL突变遵循常染色体隐性遗传模式,有19个SNP突变遵循常染色体隐性遗传模式。最后引入表型数据库来辅助进一步缩小范围。表型数据库包括OMIM和ClinVar,其他的还包括DisGeNet、HPO以及PheGenI等。通过这一步的过滤,最终挑选了四个候选突变基因,分别是符合常染色体隐性遗传模式的MEF2A,符合常染色体显性遗传模式的KRAS,符合复合杂合遗传模式的rs147640812,rs117497991;3.通过对突变基因位点的靶向设计,加入先证者同表型哥哥的DNA信息进行辅助验证,挑选出MEF2A作为候选研究突变基因,理由有两点:①该基因突变位点只存在于先证者和先证者哥哥的DNA中,不存在于其健康父母中;②基因型统计结果中,排除rs147640812、rs117497991的理由均为先证者与哥哥的基因型不相符;排除KRAS是因为KRAS符合显性遗传模式,而纯合子与杂合子均应发病,这与家系的表型不相符;确定MEF2A为候选基因的理由是该基因符合常染色体隐性遗传模式,先证者与其哥哥均为杂合突变,而父母则不含该突变,符合遗传规律;4.集落形成实验结果显示:MEF2A突变型过表达、MEF2A野生型过表达、MEF2A干扰表达对正常造血均有抑制作用;主要是抑制红系和粒系集落生成;5.MEF2Afl/fl;Vav-Cre+/-和MEF2Afl/fl;Vav-Cre-/-小鼠构建是成功的,造血系统中mRNA的MEF2Afl/fl;Vav-Cre+/-水平均低于MEF2Afl/fl;Vav-Cre-/-,统计结果具有显著性差异;6.MEF2Afl/fl;Vav-Cre+/-和MEF2Afl/fl;Vav-Cre-/-小鼠的外周血血细胞成分与计数、比例,均无统计学差异,说明该基因在骨髓中敲降表达不会影响正常造血功能。