骨整合指假体植入后假体界面与宿购买IDN-6556主骨组织之间形成的牢固连接,优良的骨整合是实现假体植入后长期稳定、延长假体使用寿命的关键因素。然而,临床上接受关节置换手术的患者多数为老年患者,常伴有骨质疏松,在假体植入后由于局部骨质不良、骨再生能力不佳,造成骨整合效果不理想,从而导致术后假体松动、移位和假体周围骨折等并发症高发。为提升骨整合效率,通过新兴的3D打印技术制备的个性化假体,在宏观上与植入位置的骨缺损高度匹配,在微观上可控的微孔结构提供初始稳定性、降低弹性模量、诱导骨长入与骨整合。然而,临床上广泛使用的3D打印钛合金假体仍具有一定的生物惰性,在骨质疏松状态下的骨整合效率还有待进一步提高。目前有研究表明,骨质疏松状态下的骨再生和骨整合能力不足,可能是部分由于骨质疏松源性骨髓间充质干细胞(Osteoporosis derived bone marrow mesechymal stem cell,OP-BMSCs)低下的自噬能力导致细胞活性和增殖能力下降,成骨分化不足,趋向于成脂分化而造成。因此,在利于骨长入的3D打印微孔假体界面负载激活OP-BMSCs自噬活性的药物,是恢复OP-BMSCs细胞活性和功能、促进假体界面骨整合的潜在策略。针对上述问题,本研究拟设计自噬激活剂——雷帕霉素的两种递送策略来加强3D打印假体界面的骨整合效果,具体方法如下:(1)研究体系一:经皮超声介导雷帕霉素递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合:(1).Ti_6Al_4V粉末为原料,利用3D打印电子束熔融技术成功制备了孔径为800μm,孔隙率约为70%的钛合金微孔假体,并对获得支架的表面形貌和力学性能进行分析。(2).通过双侧卵巢切除术法制备骨质疏松兔子模型,提取和培养BMSCs,使用流式细胞学对BMSCs典型的细胞表面抗原表达特点(CD45、CD90、CD105)进行分析以及成骨、成软骨和成脂三向分化能力进行鉴定。(3).首先通过体外检测超声介导雷帕霉素递送药物浓度与作用时间的关系,使用FITC-雷帕霉素体内递送,通过对皮肤、肌肉和骨的组织学观察确定在超声电导仪的频率为30 k Hz,强度为45 W/cm~2,时间为10 min时超声介导雷帕霉素递送的安全性和有效性;随后通过Western Blot检测细胞中自噬关键蛋白m TOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的表达水平,Ad-m Cherry-GFP-LC3B双荧光腺病毒感染细胞以及透射电子显微镜观察细胞内MK-1775配制自噬泡形成情况,综合评估超声递送雷帕霉素对OP-BMSCs自噬水平的影响。(4).探究超声介导雷帕霉素递送对OP-BMSCs的功能调节,主要包括CCK-8法检测细胞增殖,Calcein-AM/PI细胞活死染色分析细胞活性,鬼笔环肽染色观察细胞骨架,细胞划痕实验和Transwell实验检查细胞迁移能力,茜素红染色、RT-q PCR和免疫荧光染色探究细胞成骨分化情况,油红O染色分析细胞成脂肪分化能力。(5).植入3D打印微孔假体至兔左侧股骨远端外侧髁,观察超声介导雷帕霉素递送促进骨质疏松状态下假体界面骨整合,主要包括Micro-CT、硬组织切片和力学测试评估界面骨整合与周围骨质情况,界面周围骨质m TOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的蛋白水平检测评估自噬变化,界面周围骨质RT-q PCR和免疫荧光染色观察成骨相关标记物的表达。(2)研究体系二:功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合(1).通过交联N-羧乙基壳聚糖(CEC)、纳米银线(Ag NW)、聚乙烯醇(PVA)、琼脂糖和甘油合成CEC-PVA-Ag NW水凝胶,并表征水凝胶的流变学特征、力学性质、微观形貌、降解、生物相容性等理化性质。(2).制备3D打印微孔假体,并将负载雷帕霉素的水凝胶与微孔假体复合构建3D打印生物活性界面;评估3D打印生物活性界面的药物释放曲线以及对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌性能。(3).通过Western Blot检测细胞中自噬关键蛋白m TOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的表达水平以及Ad-m Cherry-GFP-LC3B双荧光腺病毒感染细胞,评估3D打印生物活性界面对OP-BMSCs自噬的影响。(4).探究3D打印生物活性界面对OP-BMSCs的功能调节,主要包括CCK-8法检测细胞增殖,Calcein-AM/PI细胞活死染色分析细胞活性,鬼笔环肽染色观察细胞骨架,茜素红染色和RT-q PCR探究细胞成骨分化情况,油红O染色分析细胞成脂肪分化能力。(5).将3D打印生物活性假体界面植入兔左侧股骨远端外侧髁,观察其在骨质疏松状态下的骨整合情况,主要包括Micro-CT评估骨长入,硬组织切片评估骨整合效果,力学测试评估界面骨整合与周围骨质情况,界面周围骨质m TOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的蛋白水平检测评估自噬变化,界面周围骨质RT-q PCR和免疫荧光染色观察成骨相关标记物的表达。(6).3D打印生物活性界面植入含有S.aureus和MRSA的股骨远端骨缺损中,评估在感染状态下假体界面的骨整合,包括血液学检查评Biomass distribution估全身感染状态,影像学、硬切片组织学和力学测试评估假体界面骨整合效果。通过这两个体系研究发现,无论是经皮超声介导雷帕霉素递送还是功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送,都可以通过激活OP-BMSCs自噬活性来提高细胞活性和成骨分化能力,同时抑制成脂分化,从而促进3D打印微孔假体界面在骨质疏松状态下的骨整合。此外,功能化水凝胶中由于Ag NW的引入赋予了3D打印生物活性界面独特的抗菌性能,可以有效的预防假体周围感染。