背景与目的:众所周知,我国是胃癌的高发国家,而幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染则是其发生发展的重要使动因素。对于H.pylori感染引起的早期胃癌,我们通常可以采用EMR(endoscopic mucosal resection,EMR)等手术进行治疗,但仍有部分患者因H.pylori持续感染而进一步发展为晚期胃癌。目前在关于预防胃癌的共识中,国内外均指出:根除H.pylori是关键的一级预防措施。虽然现在根除H.pylori的相关治疗方案很多,但仍有部分患者无法成功根除,其中,细菌内化是H.pylori根除失败的重要原因之一。新近研究发现,H.pylori不仅只粘附在胃黏膜细胞表面,还可以侵袭进入细胞内并进一步定植与存活。H.pylori的细菌内化可biological optimisation以使其逃避抗生素的抗菌作用,从而避免被抗生素抑制或杀灭,之后一旦条件适宜便可从细胞中再次出来,定植于胃黏膜表面并进行大量繁殖。此外,相关研究也证实,与根除成功的H.pylori菌株相比,根除失败的H.pylori菌株其内化水平明显更高,这提示细菌内化可能是H.pylori无法成功根除的重要原因。由此可见,寻找出有效针对H.pylori内化的治疗靶点,将为制订高效的H.pylori根除方案奠定理论基础。自噬是细胞利用溶酶体将细胞中内容物进行降解的过程,它不仅普遍参与细胞正常的生理过程,同时又在多种疾病的病理过程广泛存在。近年来,自噬与微生物感染的关系逐渐成为研究热点,然而,在宿主抵抗微生物感染的防御机制中,自噬发挥的作用尚不十分清楚,其在机体清除H.pylori感染这一重要的微生物防御/炎症免疫调节机制等方面也仍然不明确。基于目前对H.pylori和自噬-溶酶体通路的研究,我们认为,深入阐明H.pylori如何逆向调控自噬-溶酶体通路的分子机制,并找到靶向激活并修复自噬-溶酶体通路的药物,对机体通过自主防御系统清除H.pylori至关重要。小檗碱(Berberine)又称黄连素,在临床中主要用于肠道感染的治疗。小檗碱抗菌谱较广,体外对金葡菌、溶血性链球菌、霍乱弧菌等多种革兰氏菌均具抑菌作用,且与青霉素、链霉素等并无交叉耐药性。目前,随着H.pylori耐药的不断增多,小檗碱在抗H.pylori方面的潜在作用也受到关注。研究证selleck激酶抑制剂实,小檗碱在体外可发挥抗H.pylori的作用(MIC50=12.5mg/ml)。还有研究认为,在传统三联方案的基础上增加小檗碱,可以提高H.pylori根除率及改善相关临床症状。然而,小檗碱的具体抗菌机理尚未完全阐明,其对胞内H.pylori是否有清除作用也尚未见报道。基于以上研究背景,考虑到自噬-溶酶体通路在防御微生物侵染过程中的重要意义,以及近年来抗菌领域中小檗碱的潜在应用优势。我们提出假设:小檗碱可通过靶向激活并修复自噬-溶酶体通路进而清除胞内H.pylori。本课题研究将针对以上问题进行探讨,为开发根除H.pylori感染的新方案提供理论依据。材料方法:(一)验证小檗碱对体内外H.pylori的清除作用1.小檗碱对胞内H.pylori的清除作用:通过构建H.pylori感染HFE145细胞模型观察小檗碱对胞内H.pylori的清除作用,采用q RT-PCR检测胞内H.pylori特异性16S r DNA的含量,采用免疫荧光观察H.pylori的定位及表达,采用CFU实验计数H.pylori的菌落数量等。2.小檗碱对小鼠体内H.pylori的清除作用:通过构建H.pylori感染C57BL/6小鼠模型观察小檗碱对小鼠体内H.pylori的清除作用,采用q RT-PCR检测细胞内H.pylori特异性16S r DNA的含量,采用免疫荧光观察NSC 125973体内实验剂量H.pylori的定位及表达,采用CFU实验计数H.pylori的菌落数量等,并进一步通过q RT-PCR及H&E染色观察小鼠胃组织中的炎症反应。3.小檗碱对人体胃黏膜上皮细胞内H.pylori临床耐药菌株的清除作用:通过构建H.pylori临床耐药分离菌株(532和536)感染HFE145细胞模型,观察小檗碱对H.pylori临床耐药菌株的清除作用,采用q RT-PCR检测细胞内H.pylori特异性16S r DNA的含量。(二)明确小檗碱靶向激活并修复自噬-溶酶体通路进而清除H.pylori1.明确小檗碱能激活自噬-溶酶体通路:通过透射电子显微镜观察小檗碱对H.pylori感染细胞中自噬相关超微结构的影响。2.明确小檗碱通过自噬-溶酶体通路进而清除H.pylori:抑制自噬流关键节点(使用自噬抑制剂3-MA、WM及Baf-A1)后观察小檗碱清除胞内H.pylori的作用,敲除自噬相关基因(使用si ATG5及si BECN1)表达后观察小檗碱清除胞内H.pylori的作用,并通过q RT-PCR检测H.pylori特异性16S r DNA的含量。3.明确小檗碱能修复H.pylori感染中受损的自噬-溶酶体通路:通过Western blot检测小檗碱对H.pylori感染细胞以及H.pylori感染小鼠中相关自噬-溶酶体蛋白水平的表达影响,并进一步通过Western blot检测抑制自噬流形成后小檗碱对H.pylori感染细胞中相关自噬-溶酶体蛋白水平的表达影响。(三)探讨可介导参与小檗碱通过自噬-溶酶体通路清除H.pylori的相关分子1.在细胞模型中进行探讨验证:通过查阅小檗碱相关最新文献报道,探讨可能介导参与小檗碱通过自噬-溶酶体通路清除H.pylori的相关分子,进一步通过基因沉默技术敲除细胞中相关分子表达后,采用q RT-PCR检测小檗碱对胞内H.pylori清除作用的变化,并采用Western blot检测小檗碱对调控细胞中相关自噬-溶酶体蛋白水平表达的变化。2.在基因敲除小鼠模型中进行探讨验证:通过构建基因敲除小鼠模型,验证相关分子是否同样介导小檗碱通过自噬-溶酶体通路清除小鼠体内H.pylori,采用q RT-PCR、免疫荧光及CFU实验观察小檗碱在基因敲除小鼠体内对H.pylori清除作用的变化,并进一步通过Western blot检测小檗碱对基因敲除小鼠体内相关自噬-溶酶体蛋白水平表达的调控变化。(四)寻找小檗碱激活并修复的关键下游靶基因并验证1.通过转录组测序寻找具有差异表达的自噬相关基因:首先分别将各组数据进行整合,然后通过建立自噬相关的重叠基因集以进一步缩小下游目标基因的范围,寻找具有差异表达的自噬相关基因。2.筛选出小檗碱激活并修复自噬-溶酶体通路中的关键下游靶基因:通过体内外多个实验筛选出关键下游靶基因,并通过Western blot检测其在蛋白水平上的变化是否与转录水平一致。3.对关键下游靶基因进行验证:首先在NLRP3敲除细胞及小鼠模型中,采用Western blot检测关键下游靶基因的蛋白表达水平;并进一步使用si RNA沉默关键下游靶基因表达后,采用q RT-PCR检测敲除关键下游靶基因后对小檗碱清除胞内H.pylori作用的影响,采用Western blot检测敲除关键下游靶基因后对小檗碱修复相关自噬-溶酶体蛋白水平的影响。(五)阐明小檗碱调控关键下游靶基因的具体机制1.预测可能激活关键下游靶基因的转录因子:通过NCBI数据库提取关键下游靶基因的启动子序列,然后利用数据库(JASPAR、PROMO)寻找关键下游靶基因的转录因子,并在STRING数据库通过蛋白互作网络进一步预测。2.验证转录因子在上下游关系中的具体调控机制:通过免疫共沉淀(Co-IP)、Western blot、免疫荧光、染色质免疫共沉淀(Ch IP)以及基因沉默等方法,进一步深入阐明转录因子在上下游关系中的具体调控机制。结果:(一)验证小檗碱对体内外H.pylori的清除作用1.小檗碱可有效清除胞内H.pylori:在H.pylori感染HFE145细胞模型中,q RT-PCR、免疫荧光及CFU结果显示小檗碱可明显减少细胞内H.pylori的含量。2.小檗碱可有效清除小鼠体内H.pylori:在H.pylori感染C57BL/6小鼠模型中,q RT-PCR、免疫荧光及CFU结果显示小檗碱可明显减少小鼠体内H.pylori的含量,此外,q RT-PCR及H&E染色结果显示小檗碱可明显减轻小鼠体内胃组织中的炎症反应。3.小檗碱可有效清除人体胃黏膜上皮细胞内H.pylori临床耐药菌株:在H.pylori临床耐药分离菌株(532和536)感染HFE145细胞模型中,q RT-PCR结果显示小檗碱可明显减少人体胃黏膜上皮细胞内H.pylori临床耐药菌株的含量。(二)明确小檗碱靶向激活并修复自噬-溶酶体通路进而清除H.pylori1.明确小檗碱能激活自噬-溶酶体通路:通过观察透射电镜,我们发现与对照组细胞中自噬相关超微结构相比,在单纯H.pylori感染组中可看到多个双层膜、并包绕有菌体等成分的自噬体;而在小檗碱处理组中可看到多个包裹并降解菌体等成分的自噬溶酶体。2.明确小檗碱通过自噬-溶酶体通路进而清除H.pylori:通过使用自噬抑制剂3-MA、WM及Baf-A1抑制自噬流关键节点,使用si ATG5及si BECN1敲除自噬相关基因表达后,我们发现在H.pylori感染情况下,小檗碱处理组细胞中H.pylori特异性16S r DNA的含量均显著增加。3.明确小檗碱能修复H.pylori感染中受损的自噬-溶酶体通路:通过Western blot检测细胞与小鼠中相关蛋白的表达情况,我们发现H.pylori感染可导致LC3B-II蛋白减少、p62蛋白积累和CTSD蛋白从其前体转化为成熟形式的停滞,而小檗碱处理组中可发现LC3B-II蛋白水平增加、p62蛋白水平降低和促进CTSD蛋白向成熟形式的转化。(三)探讨可介导参与小檗碱通过自噬-溶酶体通路清除H.pylori的相关分子1.在细胞模型中进行探讨验证:我们发现TLR4与NLRP3可能是介导小檗碱激活并修复自噬-溶酶体通路的相关分子,通过si RNA分别敲除细胞中TLR4与NLRP3表达后,采用q RT-PCR检测结果显示,与正常细胞组相比,TLR4敲除细胞组中H.pylori的含量没有明显变化,而NLRP3敲除细胞组中H.pylori的含量显著增加。此外,采用Western blot检测细胞中自噬相关蛋白的表达结果显示,在si NLRP3转染组中,无论是否给予小檗碱,H.pylori感染细胞中LC3B-II、p62和CTSD蛋白水平的变化均未见明显差异。2.在基因敲除小鼠模型中进行探讨验证:通过鼠尾基因鉴定确认基因敲除小鼠模型构建成功后,我们采用q RT-PCR、组织免疫荧光及CFU实验检测发现,与野生型H.pylori感染组小鼠相比,无论是否给予小檗碱处理,NLRP3基因敲除小鼠体内的H.pylori含量未见明显变化。此外,通过Western blot检测小鼠胃组织中相关蛋白的表达情况,结果发现,在NLRP3基因敲除小鼠中,无论是否给予小檗碱处理,其LC3B-II蛋白、p62蛋白和CTSD蛋白水平的变化也均未见明显差异。(四)寻找小檗碱激活并修复的关键下游靶基因并验证1.通过转录组测序寻找具有差异表达的自噬相关基因:首先将以上四组数据整合测序后利用DESeq2软件进行差异表达基因分析,接着在H.pylori感染组和小檗碱组中找出表达相反的自噬相关差异基因,然后通过组间两两比较取其交集并进行汇总,最终筛选出10个自噬相关差异基因在H.pylori感染组被抑制同时又在小檗碱处理组被修复。接下来,我们将聚焦于这10个潜在下游靶基因进行后续的筛选与验证。2.筛选出小檗碱激活并修复自噬-溶酶体通路中的关键下游靶基因:通过体内外多个转录水平的实验结果,我们将关键下游靶基因聚焦于EIF2AK4,通过Western blot检测其蛋白层面的表达情况,结果显示EIF2AK4在蛋白水平的表达变化与m RNA水平表达变化一致。3.对关键下游靶基因进行验证:在NLRP3敲除细胞及小鼠模型中,Western blot结果显示小檗碱调控EIF2AK4蛋白表达水平的功能被抑制;进一步使用si RNA沉默关键下游靶基因EIF2AK4表达后,q RT-PCR结果显示敲除EIF2AK4后小檗碱清除细胞内H.pylori的作用被显著抑制,Western blot结果显示敲除EIF2AK4后小檗碱修复相关自噬-溶酶体蛋白水平的功能被抑制。(五)阐明小檗碱调控关键下游靶基因的具体机制1.预测可能激活关键下游靶基因的转录因子:我们在NCBI、JASPAR、PROMO及STRING数据库提取并分析相关数据,并根据蛋白互作网络预测到STAT1可能是通过NLRP3介导进而与EIF2AK4上游启动子结合的转录因子。2.验证转录因子在上下游关系中的具体调控机制:免疫共沉淀(Co-IP)结果显示NLRP3与STAT1之间存在蛋白相互作用;免疫荧光结果显示小檗碱可促进STAT1蛋白在细胞核中的表达;Western blot结果显示NLRP3可能促进STAT1蛋白入核;染色质免疫共沉淀(Ch IP)结果显示在小檗碱处理组中,STAT1可以直接结合到EIF2AK4上游的启动子上。此外,进一步通过si RNA敲除STAT1表达后,Western blot结果显示在敲除STAT1组中,小檗碱上调EIF2AK4蛋白水平的功能被显著抑制。结论:1.H.pylori可通过抑制宿主细胞自噬-溶酶体通路逃避清除,进而在宿主细胞内存活。2.NLRP3可介导参与小檗碱通过自噬-溶酶体通路清除H.pylori。3.小檗碱通过靶向NLRP3,促进转录因子STAT1入核激活下游EIF2AK4的表达,修复自噬-溶酶体通路,并进一步有效清除胞内H.pylori。