目的:天然产物是临床药物的重要来源,具有毒副作用小、多靶协同作用等优势。天然产物的药理研究对天然产物购买MLN8237的应用和新药的发现具有重要作用。甘松新酮是一种来自传统药用植物匙叶甘松的主要活性成分之一,具有包括抗炎、抗疟、抗肿瘤等多种药理活性,但缺少针对主要活性成分单体的生物活性机制的研究。铁死亡是一种由铁依赖性的脂质过氧化过程引发,最终导致质膜破裂和细胞死亡的新型程序性细胞死亡方式。铁死亡在机制上区别于凋亡、自噬和坏死等所有已发现的程序性死亡,是目前最具潜力的肿瘤治疗新靶点之一。随着研究的深入,越来越多的研究开始关注天然产物在铁死亡过程中的作用和机制。甘松新酮是一种带有过氧桥结构的小分子活性天然产物。一些含有这种结构的天然产物,如Nirmatrelvir配制青蒿素类化合物等,普遍具有铁死亡诱导活性,但甘松新酮在铁死亡过程中的作用仍处于未知。本课题通过体外实验验证了甘松新酮的抗肿瘤效果;并验证了甘松新酮诱导细胞死亡的途径;通过蛋白质组学研究,进一步探讨了甘松新酮诱导肿瘤细胞发生铁死亡的机制。研究结果为甘松新酮作为一种特异性铁死亡诱导剂提供了实验依据和理论基础。方法:1.以铁死亡敏感细胞系,人纤维肉瘤HT-1080细胞作为研究对象,使用细胞活性检测方法检测甘松新酮对肿瘤细胞生长的抑制作用,同时使用多种类型的细胞死亡抑制剂,检测其对甘松新酮药效的影响,确定甘松新酮诱导细胞死亡的途径。2.使用细胞活性检测方法结合细胞形态观察,检测甘松新酮诱导铁死亡的时间依赖性,比较甘松新酮相对于经典铁死亡诱导剂Erastin和具有相似结构的天然产物铁死亡诱导剂青蒿琥酯的铁死亡诱导时间上差别,并确定铁死亡生化特征变化的最佳检测时间。3.铁死亡具有细胞内ROS(Reactive oxygen species,活性氧)水平提高、脂质过氧化物累积和细胞内铁含量增高的典型生物化学特征:(1)使用流式细胞术和荧光显微共聚焦成像检测细胞内的活性氧和脂质过氧化物水平变化。(2)使用电感耦合等离子体质谱方法检测细胞内的总铁水平变化。4.甘松新酮的α,β-不饱和酮结构作为亲电基团,通常表现为作为麦克加成反应的活性受体,与蛋白的半胱氨酸亲核残基发生共价结合。使用基于竞争的化学蛋白质组学方法,研究甘松新酮在HT-1080蛋白质组中的潜在共价靶点。5.以HT-1Rapid-deployment bioprosthesis080细胞作为研究对象,分为给药组和对照组,对两组细胞进行非标记定量的蛋白质组学分析,检测受到甘松新酮影响的蛋白质组变化,结合生物信息学手段对甘松新酮的作用过程差异化表达蛋白进行分析。6.根据分析结果,选取可信度较高且具有显著丰度变化的多种铁死亡相关蛋白,利用Western Blot方法进行验证,并通过对下游代谢产物进行检测,进一步揭示甘松新酮诱导铁死亡的机制。结果:1.甘松新酮可以诱导肿瘤细胞的死亡,且凋亡抑制剂和坏死抑制剂都不能影响甘松新酮的药效,只有铁死亡抑制剂对甘松新酮的肿瘤杀伤效果产生显著的抑制作用,甘松新酮特异性诱导HT-1080细胞铁死亡。2.以24 h的最小致死浓度条件下给药,在2 h内甘松新酮就对细胞活性产生明显的抑制作用,计算半致死时间为5.2 h,相比于半致死时间分别为19.6 h和6.8 h的Erastin和青蒿琥酯,甘松新酮具有更高的铁死亡诱导效率。3.甘松新酮可以在较短时间内引发细胞内活性氧、脂质过氧化物和细胞内铁含量的升高,进一步说明了甘松新酮具有铁死亡诱导活性,可以快速引发铁死亡相关的生化指标发生变化。4.IA-Alkyne(N-(5-Hexyn-1-yl)-2-iodoacetamide,炔基碘乙酰胺)是一种特异性靶向半胱氨酸残基的探针,利用上述探针以竞争方式,在HT-1080细胞原位和裂解液中分别检测甘松新酮结合的蛋白,甘松新酮与上述探针没有明显的竞争现象,甘松新酮未与HT-1080蛋白质组的半胱氨酸发生共价结合。5.基于LC-MS/MS(Liquid chromatography-mass spectrometry,液相色谱-串联质谱)的蛋白质组学分析,共鉴定到4713种蛋白,在细胞暴露于甘松新酮后,(1)共有473种蛋白丰度出现显著性差异,包含381种蛋白被下调,92种蛋白被上调,(2)根据KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,甘松新酮通过上调铁死亡、铁元素的摄取和脂质代谢相关过程蛋白,诱导铁死亡的发生,(3)甘松新酮与经典铁死亡诱导剂不同,不通过抑制以GSH(Glutathione,谷胱甘肽)作为还原性底物的脂质过氧化物的还原过程诱导铁死亡。6.甘松新酮通过增加细胞的铁摄取,促进血红素降解释放亚铁离子,减少铁蛋白的外排,提高细胞内的铁水平,同时通过促进自由基的产生,诱导铁死亡。利用WB(Western Blot,蛋白质免疫印迹)方法验证了相关蛋白受甘松新酮影响的丰度变化,细胞内亚铁离子的积累进一步证实了我们提出的机制。结论:甘松新酮可以特异性诱导铁死亡,在HT-1080细胞中几乎不影响细胞的凋亡和坏死过程,并且可以在较短时间内快速诱导细胞发生铁死亡。甘松新酮不抑制脂质过氧化物的还原过程,但可以通过多种途径协同诱导细胞的铁死亡过程,一方面,甘松新酮通过直接增加细胞的铁摄取和亚铁离子的释放增加,破坏细胞的铁稳态,同时加速自由基的产生直接诱导铁死亡的发生。