研究背景与目的类风湿性关节炎(RA)是一种以滑膜炎症为主要临床特征的对称性、多发性、进行性和全身性的自身免疫疾病。RA是十大慢性疾病之一,不仅严重影响人们的生活质量,同时也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。中药在预防和治疗RA方面具有独特的优势,不仅可以缓解西药的毒副作用,而且具有多成分、多靶点、多通路调节疾病的特点。灰毛党参为桔梗科党参属植物灰毛党参Codonopsis canescens Nannf.的地上部分,有干黄水、消肿之功效,常用于RA、湿疹和麻风病等疾病的治疗。细胞表面的Toll样受体(TLRs),特别是TLR2和TLR4,在RA的发生发展中起着重要作用,核转录因子p65(NF-κB p65)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是TLR2、TLR4活化后的共同下游分子,也是关键的效应分子。因此,这些靶点与RA的发展密切相关,也是TLRs/MAPKs/NF-κB信号通路的重要靶点。但中药成分既可能通过直接调控TLRs/MAPKs/NF-κB信号通路的这些重要靶点,也可能通过调控这些重要靶点的上下游靶点,或同时对重要靶点与其上下游靶点进行调控发挥抗RA作用。鉴于此,本研究首先采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术鉴定灰毛党参总提取物化学成分;然后,建立胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型,基于TLRs/MAPKs/NF-κB信号通路的重要靶点揭示灰毛党参调控抗RA的物质基础与作用机制;最后,基于分子对接技术阐明灰毛党参直接与间接调控抗RA信号通路TLRs/MAPKs/NF-κB重要靶点TLR2、TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK的活性成分,以为灰毛党参抗RA临床应用及新药开发提供参考依据。研究方法与结果1.基于UPLC-Q-TOF-MS技术的灰毛党参总提取物化学成分鉴定研究采用UPLC-Q-TOF-MS对灰毛党参总提取物成分进行研究,在负离子模式下,获取总提取物成分的总离子流图,基于成分精确分子量、离子碎片以及文献,共鉴定出34个灰毛党参主要成分,其中黄酮类15个、苯丙素类7个、萜类4个、有机酸类4个、酯类2个、多炔类2个。2.基于CIA模型及重要靶点的灰毛党参调控TLRs/MAPKs/NF-κB抗RA物质基础及作用机制研究采用牛Ⅱ型胶原乳液注射法诱发大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型。测定大鼠体质量与足肿胀度,分析关节炎指数与免疫器官指数,通过HE染色法观察各组大鼠滑膜组织病理变化情况,应用ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的水平,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠TLR2、TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达情况。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠体质量显著降低(P<0.01);足肿胀度显著升高(P<0.05,P<0.01);关节炎指数显著升高(P<0.01);免疫器官指数显著升高(P<0.01);滑膜组织病理损伤明显;血清中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平Lipid-lowering medication显著升高(P<0.01);滑膜组织中TLR2、TLR4、NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,灰毛党参提取物各剂量组体质量显著升高(P<0.01);足趾肿胀寻找更多度显著降低(P<0.01);关节炎指数显著降低(P<0.01);免疫器官指数显著下降(P<0.01);滑膜组织增生及炎症细胞浸润等病理变化减轻;血清中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05,P<0.01);TLR2、TLR4、NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK的蛋白表达量显著降低(P<0.05,P<0.01)。3.基于分子对接技术的灰毛党参直接与间接调控TLRs/MAPKs/NF-κB通路重要靶点的活性成分研究首先,利用TCMSP数据库基于口服生物利用度(OB)及类药性(DL)参数对灰毛党参的活性成分进行了筛选,共筛选出9个OB≥10%、DL≥0.18的活性化合物,分别是木犀草素、芹菜素、紫云英苷、柯伊利素、苜蓿素、绿原酸、秦皮甲素、党参炔苷和齐墩果酸。然后,通过KEGG数据库获取TLRs/MAPKs/NF-κB通路靶点37个,最终通过PDB数据库可以获取的人源受体靶点蛋白有32个。最后,应用Auto Dock Tools 1.5.6软件对活性成分与通路靶点进行分子对接,再利用Pymol软件将对接结果可视化。对接结果表明,9个活性成分中,齐墩果酸、木犀草素、芹菜素、柯伊利素、苜蓿素、紫云英苷和秦皮甲素可以直接调控重要靶点TLR2、TLR4、NF-κB p65和p38 MAPK发挥抗RA活性;绿原酸可以直接调控重要靶点TLR4、NF-κB p65和p38 MAPK发挥抗RA活性;党参炔苷可以直接调控重要靶点TLR2和p38 MAPK发挥抗RA活性。这表明,这些活性成分可以直接调控重要靶点发挥抗RA活性,但不同的成分对重要靶点的AZD9291直接调控作用不完全相同。另外,齐墩果酸、木犀草素、芹菜素、柯伊利素、苜蓿素和秦皮甲素对TLRs/MAPKs/NF-κB通路其它靶点均有直接调控作用,紫云英苷、绿原酸及党参炔苷对大部分其它靶点也均有直接调控作用,但直接调控活性的强弱各不相同。结论这些研究结果表明,灰毛党参活性成分既可直接调控TLRs/MAPKs/NF-κB的重要靶点TLR2、TLR4、NF-κB p65和p38 MAPK,也可以通过与通路其它靶点结合间接调控这些重要靶点发挥抗RA作用。同时,灰毛党参中木犀草素、芹菜素、紫云英苷、柯伊利素、苜蓿素、绿原酸、秦皮甲素、党参炔苷和齐墩果酸等成分是其潜在的抗RA药效物质。