目的:急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是危重症患者常见的并发症,病死率高,尚无有效药物推荐用于防治成人AKI。冬虫夏草用于治疗肾脏疾病有较好的临床疗效,虫草素是其主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等药理作用。既往有研究显示虫草素对实验性AKI有一定防治作用,然而,由于对其治疗AKI的作用机制尚未完全阐明,对其临床合理使用带来了较大影响。为此本课题利用网络药理学挖掘虫草素治疗AKI的潜在作用靶点,运用分子对接进行初步验证,通过体内体外实验进一步研究虫草素对缺血再灌注肾损伤的作用和分子机制。方法:(1)第一部分通过网络药理学挖掘虫草素治疗AKI的潜在作用靶点,分子对接进行初步验证。利用Pubchem数据库及PharmMapper数据库挖掘虫草素相关作用靶点,利用GeneCards数据库、OMIM数据库及Disgenet数据库挖掘AKI相关靶点,Cytoscape进行蛋白网络互作构建,并挖掘出核心靶点,DAVID数据库进行基因富集分析。利用AutoDock软件对虫草素与核心作用靶点进行分子对接验证。(2)第二部分通过在体实验进行虫草素改善缺血再灌注肾损伤药效验证及作用机制分析。48只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(Sham组)12只,模型组组(I/R组)18只,虫草素组(I/R+Cor组)18只。采用夹闭双侧肾动脉45min再灌注12h、24h、48h构建缺血再灌注AKI模型,于再灌注开始时,各组尾静脉注射相应剂量药物。于再灌注12h、24h、48h进行血、肾脏标本采集,行血清肌酐、尿素氮检测,HE染色及PAS染色观察肾组织病理形态,TUNEL检测细胞凋亡。透射电镜观察自噬形态变化。通过RT-qPCR及Western blot检测再灌注48h后各组大鼠肾组织中PI3K、Akt、mTOR、BecGefitinib-based PROTAC 3供应商lin-1、p62、LC3B、Bcl-2、Bax、caspase-3 的 mRNA及蛋白表达。(3)第三部分通过体外实验进一步探讨虫草素对缺血再灌注肾损伤的作用和潜在机制。以HK-2细胞为研究对象,经缺氧6 h复氧24 h建立缺氧/复氧(H/R)HK-2细胞模型。将HK-2细胞分为对照组(正常HK-2细胞)、模型组(H/RHK-2细胞)及虫草素组(建立H/R模型,复氧开始时加入不同浓度虫草素),虫草素浓度为 1 5μmol/L、30μmol/L、45μmol/L、60μmol/L、75μmol/L、90μmol/L、105μmol/L、120μmol/L、13 5μmol/L、150μmol/L。复氧 24h 后采用CCK-8法行细胞活力检测,筛选出最适虫草素浓度。为进一步明确虫草素是否通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路起到肾保护作用,再次建立H/R HK-2细胞模型,设立对照组、模型组、虫草素组及LY294002组(PI3K抑制剂)。CCK-8法行细胞活力检测,流式细胞术检测细胞凋亡;采用Western Blot检测细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTGW4869OR、Beclin-1、p62、LC3B、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达。结果:(1)第一部分结果显示有234个虫草素相关作用靶点,761个AKI相关疾病靶点,两者共有42个交集靶点,拓扑分析得到个30核心靶点,富集核心靶点分析后发现虫草素与AKI相关信号通路涉及PI3K/Akt、mTOR、细胞凋亡等多条信号通路。虫草素与PI3K/Akt/mTOR通路及自噬凋亡相关靶点PIK3CA、AKT1、mTOR、p62(SQSTM1)、LC3B、BECN1、BAX、BCL2、CASP3 进行分子对接,除与p62(SQSTM1)结合能为-4.7 kJ·mol-1外,余结合能均<-5.0 kJ·mol-1,说明虫草素与PI3K/Akt/mTOR通路及自噬凋亡相关靶点蛋白结合较好,发生作用的可能性较大。(2)第二部分,缺血45min再灌注48h时,I/R组Scr及BUN水平较sham组均升高(P<0.05),I/R+Cor组Scr及BUN水平较I/R组均下降(P<0.05)。缺血45min再灌注12h、24h、48h,I/R组大鼠肾组织损伤Pallers评分Forensic genetics及TUNEL检测凋亡细胞数明显高于Sham组(P<0.01,P<0.05),再灌注24h、48h时I/R+Cor组Pallers评分及凋亡细胞数显著低于同期I/R组(P<0.01,P<0.05)。透射电镜检测显示模型组与假手术组相比大鼠肾小管上皮细胞中自噬小体以及自噬溶酶体数量减少,而和模型组相比,虫草素干预组大鼠肾小管上皮细胞中自噬小体以及自噬溶酶体数量增加。说明虫草素能激活自噬减少细胞凋亡减轻缺血再灌注肾组织损伤。虫草素能降低缺血45min再灌注48h大鼠肾组织 p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62、caspase-3、cleaved caspase-3 蛋白表达,升高Beclin-1及凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表达,升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,降低Bax/Bcl-2比值;同时虫草素可以降低PI3K、caspase-3、Bax mRNA表达,说明虫草素可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活细胞自噬减少凋亡,从而减轻肾组织损伤。(3)第三部分,复氧24h后H/R HK-2细胞活力明显降低,而予以各浓度虫草素干预后,均可提高H/R HK-2细胞活力(P<0.001),90μM浓度组中HK-2细胞活力最强(P<0.001)。缺氧复氧损伤使HK-2细胞凋亡率明显上升,经虫草素干预后细胞凋亡率显著下降(P<0.01),虫草素与LY294002(PI3K抑制剂)均可抑制PI3K、Akt、mTOR活化,上调Beclin-1蛋白表达,下调p62蛋白表达,升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,激活细胞自噬;上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,降低Bax/Bcl-2比值,抑制caspase-3活化,减少细胞凋亡。结论:(1)网络药理学发现虫草素治疗AKI具有多靶标、多信号通路的特点,结合分子对接结果,我们认为PI3K/Akt/mTOR介导细胞自噬通路及抗凋亡作用可能是虫草素治疗AKI的重要作用途径。(2)体内体外研究证实虫草素通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路促进自噬,同时虫草素抑制细胞凋亡,改善肾小管上皮细胞功能,从而对缺血再灌注诱导AKI起到保护作用。