目的绝经过渡期是女性必经的生命阶段,伴随着激素水平的异常波动,脑内雌激素受体(Estrogen receptor,ER)网络也会随之发生变化,表现为ER的水平及敏感性下降,从而导致一系列神经精神系统症状的出现,尤其是失眠,在女性的绝经过渡期发病率明显高于其他生命阶段。临床研究显示,绝经过渡期女性的睡眠调查研究多以主观量表测试为主,且测试结果与有限的多导睡眠监测得到的客观睡眠时间并不一致。4-乙烯基环己烯二环氧化合物(4-Vinylcyclohexene Diepoxide,VCD)是一种卵巢毒性化学物质,可以模拟女性从生育期、到绝经过渡期、到绝经期的动态过程,在绝经过渡期相关疾病的研究中应用广泛,但对于睡眠-觉醒时相的研究,尚未见报道。O-连接β-N-乙酰葡糖胺(O-linkedβ-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)是细胞内蛋白质的单糖翻译后修饰,其可修饰ER,并调节ER的水平和活性。柴胡加龙骨牡蛎汤作为中医临床常用的改善女性绝经过渡期失眠的经典方剂,其作用机制尚不清楚。基于上述认识,本研究首先以VCD所致的绝经过渡期小鼠为动物模型,阐明绝经过渡期睡眠-觉醒时相的变化特点。然后在确定柴胡加龙骨牡蛎汤具有改善绝经过渡期小鼠睡眠作用的基础上,基于ERα的O-GlcNAc修饰探讨柴胡加龙骨牡蛎汤改善绝经过渡期小鼠睡眠作用的机制。方法第一部分绝经过渡期小鼠睡眠-觉醒时相的变化八周龄ICR小鼠随机分为8组,即VCD 20 d,VCD 35 d,VCD 52 d,VCD 63 d,及相应的对照组,Control 20 d,Control 35 d,Control 52 d,Control 63 d。VCD 和 Control 组小鼠每日早 8:00 分别腹腔注射VCD(160 mg/kg,0.05 mL/10 g),和相同体积的芝麻油,每日注射一次,每周连续注射5 d,连续注射4 w,共注射20 d。各组小鼠分别于注射VCD或芝麻油CP-456773供应商的第20 d、第35 d、第52 d、第63 d进行皮层脑电和肌电监测,分析其全天、日间和夜间的觉醒(WAKE)、非快速眼球运动(Non-rapid eye movements sleep,NREM)睡眠和快速眼球运动(Rapid eye movements sleep,REM)睡眠的时间,发生次数及发生的平均持续时间。第二部分 绝经过渡期小鼠下丘脑ERα、OGT、OGA、O-GlcNAc蛋白的表达实验分组及给药方法同第一部分。各组小鼠分别于注射VCD或芝麻油的第20 d、第35 d、第52 d、第63 d,采用Western blot技术,测定各组小鼠下丘脑ERα、OGT、OGA、总O-GlcNAc蛋白的表达。第三部分CJLM70E对绝经过渡期小鼠睡眠-觉醒时相的影响八周龄ICR小鼠随机分为4组,即Control组,VCD组,CJLM70E组和E_GSK21184362组。Control组腹腔注射芝麻油,其余各组均腹腔注射VCD。于注射VCD或芝麻油的第35 d,CJLM70E组灌胃给予CJLM70E(48 mg/kg,0.2 mL/10 g),E_2组灌胃给予雌二醇(0.13 mg/kg,0.2 mL/10 g),VCD组和Control组灌胃给予同体积1%CMC-Na,连续4w。各组动物在给药第1 w、第2 w、第3 w、第4 w时进行皮层脑电和肌电监测,分析其24 h Wake、NREM睡眠和REM睡眠的时间,发生次数及发生的平均持续时间。第四部分CJLM70E改善绝经过渡期小鼠睡眠作用的机制实验分组及给药同第三部分。各组小鼠于给药1 w时,采用Western blot技术测定各组小鼠下丘脑 ERα、OGT、OGA、总O-GlcNAc蛋白的表达;免疫共沉淀技术验证ERα的O-GlcNAc修饰;免疫荧光技术测定下丘脑VLPO和PVN脑区ERα和O-GlcNAc蛋白的表达。结果第一部分绝经过渡期小鼠睡眠-觉醒时相的变化与相应的 Control 组相比,VCD 20 d、VCD 35 d 和 VCD 52 d小鼠的Wake时间延长(P<0.05),NREM和REM睡眠时间缩短(P<0.05),REM睡眠发生次数降低(P<0.05);VCD 63 d小鼠的Wake和NREM睡眠发生次数升高(P<0.05),NREM睡眠发生的平均持续时间降低(P<0.05),与VCD 20 d、VCD 35 d、VCD 63 d相比,VCD 52 d小鼠的Wake时间延长,REM睡眠时间和发生次数降低(P<0.05);与 VCD 20 d、VCD 35 d、VCD 52 d 相比,VCD 63 d小鼠的Wake和NREM睡眠发生次数增加(P<0.05),发生的平均持续时间和Wake时间缩短(P<0.05)。第二部分 绝经过渡期小鼠下丘脑ERα、OGT、OGA、O-GlcNAc蛋白的表达与相应的 Control 组相比,VCD 35 d、VCD 52 d 和 VCD 63 d小鼠下丘脑ERα蛋白表达降低(P<0.05);VCD 35 d、VCD 52 d小鼠下丘脑OGT、O-GlcNAc蛋白表达降低(P<0.05)。与VCD 20 d、VCD 63 d相比,VCD 35 d、VCD 52 d小鼠下丘脑OGT蛋白水平降低(P<0.05);与 VCD 20 d、VCD 35 d、VCD 52 d 相比,VCD 63 d小鼠下丘脑O-GlcNAc蛋白表达升高(P<0.05)。第三部分CJLM70E对绝经过渡期小鼠睡眠-觉醒时相的影响与相应的Control组相比,VCD组小鼠第1、2、3 w的Wake时间延长(P<0.0 5),NREM睡眠时间缩短(P<0.05),以及第1、2 w的REM睡眠时间和发生次数降低(P<0.05),第1 w的Wake发生的平均持续时间缩短(P<0.0 5)。与VCD组相比,CJLM70E和E_2小鼠第1、2、3 w的Wake时间缩短(P<0.05),NREM睡眠时间延长(P<0.0 5),及第1、2 w的REM睡眠时间延长(P<0.05),REM睡眠发生次数降低(P<0.05),及第1 w的Wake发生的平均持续时间缩短(P<0.0 5)。第四部分CJLM70E改善绝经过渡期小鼠睡眠作用的机制Western blot结果显示:与Control组相比,VCD组小鼠下丘脑ERα、OGT、O-GlcNAlethal genetic defectc蛋白表达降低(P<0.05);与VCD组相比,CJLM70E和E_2组小鼠下丘脑ERα、OGT、O-GlcNAc蛋白表达均升高(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示:ERα和O-GlcNAc蛋白存在相互作用,VCD组相互作用程度降低,CJLM70E和E_2可使相互作用程度升高。免疫荧光结果显示:与Control组相比,VCD组小鼠VLPO和PVN脑区的ERα、O-GlcNAc蛋白表达降低(P<0.05);与VCD组相比,CJLM70E和E_2组小鼠VLPO和PVN脑区的ERα、O-GlcNAc蛋白表达升高(P<0.05)。结论1、绝经过渡期和绝经期小鼠的睡眠质量下降,且绝经期小鼠睡眠-觉醒时相无明显的昼夜节律变化。2、CJLM70E通过调节ERα的O-GlcNAc修饰改善绝经过渡期小鼠的睡眠质量。