猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是导致仔猪腹泻最重要的肠道冠状病毒之一,而目前PEDV关键受体基因尚未明确,无法从根本上培育抵抗该病毒的猪种。成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated protein 9,CRISPR/Cas9)是高效、强大的第三代基因编辑工具,将CRISPR/Cas9基因编辑系统与全基因组筛选和后续的功能基因鉴定相结合,已成功应用于病毒关键基因的筛选研究中,但尚未有PEDV的报道。因此,本研究采用CRISPR高通量筛选策略发掘PEDV复制关键候选基因,有望实现制备基因编辑猪,为猪的抗病分子育种研究提供新的方向。目的:本研究利用CRISPR/Cas9技术对PEDV复制关键基因进行全基因组筛查,并在猪源靶向细胞IPEC-J2上对候选基因MMP13进行机制性研究,为培育抗PEDV品种/品系猪提供科学参考。方法:通过CRISPR/Cas9技术构建人肝癌细胞系(Huh-7)全基因组敲除文库,利用PEDV感染Huh-7文库细胞,随后经高通量测序挖掘PEDV复制关键基因,结合分子生物学手段探讨候选基因MMP13调控PEDV的内在机制。结果:(1)本研究构建了CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因的方法。GO分析结果显示,富集到的靶基因主要参与双键断裂修复、有丝分裂细胞周期负调控和程序性细胞凋亡等生物过程;KEGG分析显示这些靶基因主要参与细胞凋亡、肿瘤转录调控、线粒体自噬以及细胞周期等信号通路;对富集排名靠前的整合素α11(integrinα11,ITGA11)、哺乳动物复制蛋白A2(replication protein A2,RPA2)、驱动蛋白家族成员2A(kinesin family member 2A,KIF2A)、诱导髓系白血病细胞分化蛋白1(induced myeloid leukemia cell differentiation protein 1,MCL1)、多聚ADP核糖化酶1(poly ADP-ribose polymerase 1,PARP1)和囊泡单胺转运蛋白1(vesicular monoamine traPevonedistat浓度nsporter,SLC18A1)基因分别合成了si RNA干扰片段,随后转染至IPEC-J2细胞后接毒,结果与对照组相比,干扰ITGA11基因可显著降低PEDV m RNA(P<0.01)、蛋白表达水平及子代病毒滴度(P<0.01);此外,PEDV感染可显著上调MMP13 m RNA和蛋白表达水平,并且与PEDV N蛋白表达趋势具有高度的相似性。(2)本研究通过合成候选基因MMP13干扰片段及过表达载体,发现IPEC-J2细胞干扰MMP13基因后可显著降低PEDV N m RNA(P<0.001)及蛋白表达水平,反之过表达MMP13基因后PEDV表达显著增强;之后使用MMP13特异性抑制剂同样降低了PEDV N的蛋白表达水平,表明MMP13基因可以作为关键基因参与BMS-907351 MW调控PEDV的复制。(3)本研究首先在IPEC-J2细胞上测定了PEDV感染后PI3K/AKT和JNK磷酸化蛋白表达情况,Western blot结果显示,PEDV感染能够激活PI3K/AKT和JNK蛋白的磷酸化,随后分别使用PI3K磷酸化抑制剂LY294002和JNK蛋白的磷酸化抑制剂SP600125处理后感染PEDV AH2012/12株,结果发现,SP600125处理后P-JNK、MMP13和PEDV N蛋白表达水平明显降低,而LY29400metastasis biology2处理后MMP13和PEDV N蛋白表达水平无明显变化,说明PEDV主要通过JNK信号通路上调MMP13的表达;其次,激光共聚焦试验和RT-q PCR结果表明,干扰MMP13基因后PEDV对细胞的吸附量极显著下降(P<0.001),而入侵、复制和释放无变化(P>0.05);反之过表达MMP13基因后PEDV对宿主细胞的吸附显著上升(P<0.05),说明MMP13主要在PEDV吸附阶段起关键作用;最后,本研究通过激光共聚焦显微镜观察发现,MMP13与主要介导PEDV吸附的靶蛋白S蛋白存在共定位现象。结论:基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除文库可作为挖掘PEDV复制相关功能基因的有效工具,筛选得到的ITGA11及MMP13基因可成为抗PEDV潜在的靶基因,从而根本上通过抗病育种途径培育出抗PEDV猪的品种或品系。