乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种包膜DNA病毒,特异性感染肝细胞,引起免疫应答反应导致急性或慢性乙型肝炎。慢性乙型肝炎可进一步发展为危及生命的疾病,如肝硬化或肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。HBV感染是世界范围内严重的公共卫生问题。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)估计,截至2019年底,全球约有2.96亿HBV感染者,且感染人数仍在持续增加,每年新增约150万人。中国是HBV感染人数最多的国家,约有7000万感染者。目前被批准用于治疗HBV感染的药物主要分为两类:干扰素和核苷(酸)类似物(Nucleos(t)ide analogues,NUCs)。然而,干扰素具有不良反应严重,患者依从性差的缺点;NUCs停药后易反弹,已出现不同程度的耐药性。上述两类药物均不能满足临床治疗的需求,因此研发作用于新靶标的高效低毒的抗HBV药物是医药卫生领域的当务之急。HBV衣壳是构成一个成熟的病毒颗粒所必需的结构蛋白,由90或120个核心蛋白(Coreprotein,Cp)二聚体组装而成,包裹保护病毒基因组,与宿主蛋白相互作用调节病毒复制周期,HBV衣壳的多功能性使其成为新药设计的热点靶标。目前已有多种结构类型的HBV衣壳组装调控剂(Capsid assembly modulators,CAMs)被报道,其中二氢嘧啶类化合物(Heteroaryldihydropyrimidine,HAP)是研究最广泛和最深入的结构之一。HAP类化合物加速Cp组装成异常衣壳,随后异常衣壳在肝细胞内被特异性识别并降解。GLS4是HAP类代表化合物,目前处于临床Ⅲ期,抗病毒活性优异。但GLS4在体内易被代谢,单独多次给药无法达到有效的血药浓度,在临床实验治疗方案中与100 mg利托那韦联合使用。然而,非治疗性药物(利托那韦)的增加大大提高了药物-药物相互作用(Drug drug interaction,DDI)和不良反应发生的风险。此外,GLS4对人类ether-à-go-go相关基因(Human ether-à-go-go-related gene,hERG)编码的通道有较强抑制作用(IC50=1.34μM),可能引起QT间期延长,进而诱发尖端扭转性室性心动过速,严重时可导致猝死。综上所述,代谢不稳定和hERG毒性较强极大地限制了 GLS4的临床应用。另一方面,HAP结合口袋内积累的突变容易产生耐药性,这些突变在未接触过CAMs的患者中少见,selleck INCB28060但在早期临床实验中突变发生率迅速上升。因此,HBV CAMs的潜在耐药性问题不容忽视,将成为未来CAMs临床治疗面临的重要问题。为了提高抗病毒活性和改善成药性,本论文第二章运用基于靶标结构的合理药物设计以及多位点结合策略,将GLS4二氢嘧啶母核6位易代谢的吗啉环替换为哌嗪环,以期改善代谢稳定性;引入可生成负离子的羧基,以期降低prostatic biopsy puncturehERG毒性;引入较大体积的疏水性基团,以期占据溶剂开口区并与附近残基形成额外的作用力,共设计合成了 34个HAP类衍生物。体外抗HBV活性筛选结果显示,Ⅰ-6a-25(EC50=0.020±0.005μM)的抗病毒活性最好,优于阳性药物拉米夫定(EC50=0.09μM),略弱于先导化合物GLS4(EC50=0.007±0.RepSox供应商003 μM)。此外,Ⅰ-6a-25能降低细胞内核心蛋白和衣壳的含量,提示它的作用机制与GLS4相似。分子模拟发现,新引入的6位取代基更好地延伸向溶剂开口区:与Ser141侧链羟基的氧原子形成氢键,以及与Pro134、Thr125和Pro138形成疏水作用。初步成药性评价表明,Ⅰ-6a-25在水溶性(pH=2.0:374.81μg/mL;pH=7.0:6.85 μg/mL;pH=7.4:25.48μg/mL)、肝微粒体代谢稳定性(t1/2=108.2 min)以及 hERG毒性(10 μM的抑制率为72.66%)方面均优于先导GLS4,具有进一步研究的价值。针对CAMs潜在耐药性问题,本论文第三章将蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis targetingchimera,PROTAC)技术应用于HAP类衍生物,以期发挥更强的降解作用,提高对野生型和突变型Cp的抗病毒活性。我们对HAP-PROTAC进行了系统的探索:在E3连接酶配体上,我们选择了 CRBN配体来那度胺;在连接基团上,我们选择柔性的烷基链或乙二醇链,长度范围为2-14个原子;在HBVCp配体上,我们选择临床Ⅲ期候选药物GLS4。除目标化合物HAP-PROTAC(B组)外,还特别设计了不含来那度胺的化合物(A组)和含甲基化来那度胺的化合物(C组)作为阴性对照,共设计合成了21个化合物。在HepDES19细胞中评价抗病毒活性,PROTAC分子(B组)中活性最好的化合物为Ⅱ-13a(EC50=0.60±0.20μM),与阳性药物拉米夫定(EC50=0.40±0.00μM)相当。在HepAD38细胞中,PROTAC分子Ⅱ-13a的细胞毒性(CC50>100μM)明显低于对照化合物Ⅱ-2a(CC50=18.3±6.0 μM)和 GLS4(CC50=50.2±0.8 μM)。选择代表性PROTAC分子Ⅱ-13a及其对照化合物Ⅱ-2a进行浓度依赖性降解实验,结果显示Ⅱ-13a与Ⅱ-2a都能剂量依赖性降低HBV Cp和衣壳的含量,并且Ⅱ-13a的降解效应强于Ⅱ-2a,说明PROTAC分子能发挥更强的降解作用,初步验证了 PROTAC技术应用在HBV Cp上的合理性和可行性。综上所述,本论文针对HBV CAMs临床候选药物存在的成药性质较差以及潜在耐药性问题,综合运用结构生物学信息、药物化学策略、蛋白降解技术等,设计合成了两个系列共55个目标化合物。一方面,经过活性评价和成药性评价,发现了成药性改善且抗病毒活性保持的优选先导化合物Ⅰ-6a-25。另一方面,基于PROTAC技术发现了新型HBV衣壳降解剂Ⅱ-13a,为抗HBV药物研发提供了新思路。