目的:合成磁性介孔硅(magnetic mesoporous silicon,MMSN)并将其作为固定α-葡萄糖苷酶的载体。随后使用α-葡萄糖苷酶修饰的磁性介孔硅从中药葛根(Pueraria lobate)中筛选其抑制剂。同时,利用敲除/敲入技术从整体的角度对几种活性成分的相互作用进行验证。期望发现具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的小分子化合物,并明确其在葛根整体中发挥的作用,为临床上治疗糖尿病提供更加稳定可靠的先导化合物。方法:1.以Fe_3O_4作为核心材料,首先利用硅酸四乙酯进行一次稳定性修饰。随后,在利用硅酸四乙酯进行第二次稳定性修饰的同时加入模板剂十六烷基三甲基氯化铵。修饰完成的材料在利用酸化乙醇去掉模板剂后即可得到磁性介孔硅。然后以3-氨丙基三乙氧基硅烷为材料进行-NH_2功能化修饰。最后,使用戊二醛作为交联剂,将α-葡萄糖苷酶修饰到-NH_2化的磁性介孔硅表面。采用傅里叶红外光谱仪和透射电子显微镜对合成的材料进行表征。2.使用诱惑红对不同粒径的磁性介孔硅、非介孔的磁性纳米材料以及未Trichostatin A抑制剂经-NH_2修饰的磁性介孔硅进行表面-NH_2含量的研究。同时还考察了合成过程中反应物的量对材料表面-NH_2数量的影响以及固定化酶和游离酶在不同温度和p H下的活性变化。3.利用配体垂钓技术从葛根中筛选潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂,并使用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对配体的结构进行了鉴定。4.利用敲除/敲入技术对葛根中发挥重要功效的α-葡萄糖苷酶抑制剂进行分析研究。同时,对敲除成分的抑制动力学也进行相关的研究。利用分子对接的手段对配体垂钓筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂进行活性验证。结果:1.α-葡萄糖苷酶修饰的磁性介孔硅的红外谱图在1557 cm~(-1)和1650 cm~(-1)处出现特征峰,这是由于C=O的伸缩振动和N-H的弯曲振动,表明了α-葡萄糖苷酶已经成功被修饰的磁性介孔硅表面。使用透射电镜分析Fe_3O_4,Fe_3O_4@n Si O_2和Fe_3O_4@n Si O_2@m Si O_2的表面形貌特征,发现Fe_3O_4@n Si O_2@m Si O_2表面具有密集的小孔,这表明了磁性介孔硅被顺利合成。2.通过材料吸附性能研究,确定了小粒径的磁性介孔硅表面可以携带的-NH_2数量最多,进而推测其表面可以固定酶的量是最多的。同时还确定了两次稳定性修饰和一次功能化修饰加入的反应物的量分别为0.2 m L、0.4 m L和6 m L时,材料表面可以负载的-NH_2数量最多,以及固定化酶相较游离酶在不同温度和p H下的稳定性更好。3.利用基于磁性介孔硅的配体垂钓技术结合UPLC-Q-TOF-MS/MS从葛根中筛选出可能的α-葡萄糖苷酶抑制剂,分别为3′-羟基葛根素葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、葛根素6′-O-木糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷、大豆苷和黄豆黄素。4.选用葛根素、大豆苷和大豆苷元进行敲除/敲入分析,结果表明大豆苷元和葛根素对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性,其IC_(50)分别为0.088±0.003 mg/m L和0.414±0.005 mg/m L。其中,葛根素在葛根药材中的含量达到40%以上,且与其他成分具有协同作用,是葛根发挥α-葡萄糖苷酶抑制活性的主要贡献者。通过抑制动力学分析确定了葛根素和大豆苷均为混合型抑制剂,大豆苷元为非竞争性抑制剂。此外,对利用配体垂钓筛选出的化合物进行分子对接验证,结果显示10个化合物均可与gastrointestinal infectionα-葡萄糖苷酶进行结合。结论:本实验成功地合成了具有较大比表面积和良好生物亲和力的磁性介孔硅,并将其作为固定α-葡萄糖苷酶的载体材料。同时,建立了一种基于磁性介孔硅的配体垂钓技术并使用其从中药葛根中快速筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。最终,成功筛选出10个配体,并利用UPLC-Q-TOF-MS/MS对配体的结构进行了鉴定。此外,为了确定多种生物活性化合物潜在的协同或AZD6738拮抗作用,本研究使用敲除/敲入的分析方法验证了配体的活性。最后发现葛根素、大豆苷和大豆苷元均具有增强其他成分抑制效果的作用。确定了葛根素是葛根抑制α-葡萄糖苷酶活性的关键成分,并对以上三种成分的抑制动力学和抑制机理进行了研究。综上,基于磁性介孔硅的配体垂钓技术结合敲除/敲入策略是筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂并评估它们在葛根中的多组分相互作用的有效方法。