研究背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种缓慢进展的慢性疾病,当AS斑块破裂可导致一系列急性临床事件,如心肌梗死或中风,这是导致患者发病、死亡、致残的主要原因。其中,不稳定的颈动脉斑块会增加缺血性中风的风险。近年来,斑块易损性的概念不断发展,在预测急性脑血管事件发生风险方面取得了一定进展。但无论是无创成像技术还是循环生物标志物目前都缺乏足够的敏感性和特异性,无法在临床实践中进一步得到证实。对造成斑块不稳定的分子机制和斑块进展的机制进行深入了解,有助于识别代表不稳定斑块的生物标志物。研究目的:本研究拟以颈动脉斑块作为研究对象,进行基于数据非依赖性采集质谱技术(DIA-MS)的蛋白质组学定量分析,筛选出不同类型斑块中具有显著差异的蛋白,探讨不同类型斑块的蛋白质特征,以期找到影响斑块不稳定及斑块进展的新角色蛋白。研究方法:首先收集在北京协和医院血管外科接受颈动脉内膜剥脱术的患者颈动脉斑块标本及临床资料100例,建立临床研究队列。首先对斑块标本进行HE染色,根据AHA分级标准对斑块进行分类,第一部分为稳定和不稳定斑块组,第二部分为AHA Ⅳ型、V型、Ⅵ型斑块。在筛选阶段,通过DIA-MS高通量蛋白质组学检测方法对颈动脉斑块进行检测,通过筛选后,第一部分最终纳入37例稳定斑块和45例不稳定斑块,第二部分纳入29例AHA Ⅳ型斑块,20例AHAV型斑块,38例AHAVI型斑块。倍数变化FC≥2和P-Value<0.05的蛋白质被认为是差异表达蛋白(DEPs)。筛选不同分组之间的DEPs,并对DEPs进行生物信息学分析,探索分子通路机制。在验证阶段,另外收集40例患者的颈动脉斑块标本对筛选出的差异蛋白进行验证,同样首先进行HE染色,剔除无法分类的斑块后,第一部分共纳入稳定斑块20例,不稳定斑块15例。第二部分分为10例AHA Ⅳ型斑块,10例AHA V型斑块,15例AHA Ⅵ型斑块,利用免疫组化技术(IHC)对颈动脉斑块横断面中AM-2282生产商阳性染色细胞的密度进行了量化,验证蛋白质组学的结果。研究结果:在蛋白筛选阶段,其中稳定组斑块和不稳定组斑块根据DIA数据最终纳入筛选的蛋白3999个,DEPs共397个。通过疾病和功能分析注释显示稳定组和不稳定组差异蛋白的功能主要集中于细胞死亡和脂质代谢方面,发现7种铁死亡相关蛋白(SLC1A5、AIFM2、BID、DPP4、TFR1、TF 和 GCLC)和CL13900核磁 2 种脂质代谢相关蛋白(AAuxin biosynthesisPOA5、CETP)在不稳定斑块组表达显著上调。炎症相关蛋白(CD44)在稳定斑块组中表达较低,在不稳定斑块组中显著地升高。自噬相关蛋白(MTOR)则表现出相反的趋势。蛋白CETP与临床指标CRP之间存在明显的正相关性,蛋白GCLC和AIFM2之间存在正相关性。AHA Ⅳ和Ⅴ型筛选出DEPs 453个,AHA Ⅴ和Ⅵ型筛选出DEPs 302个,AHA Ⅳ和Ⅵ型筛选出DEPs 438个,AHA Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型斑块蛋白质组之间的疾病和功能分析注释大部分集中于凋亡、自噬、细胞骨架的形成相关的蛋白上,呈现出不同的表达强度,而脂质代谢、细胞形态、蛋白质合成、细胞移动与功能和细胞间的信号传递与相互作用相关的蛋白在三组不同AHA分型中分别被激活,共筛选出4个在AHA Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型中呈现逐渐上调的蛋白,21个在AHA Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型中呈现逐渐下调的蛋白,主要涉及的功能区包括细胞凋亡,细胞骨架的形成,自噬,分子的运输,细胞质的发展,细胞扩散,血管生成和自由基清除。通过进一步评估DEPs,发现在AHA Ⅳ型斑块与AHA Ⅵ型斑块之间发现铁稳态及细胞增殖迁移相关蛋白(TF、MTOR、SMAD3、TFR1),免疫及炎症反应相关蛋白(CD44、DPP4、TREM2、IL-6R、GAL-1)存在差异显著。在蛋白验证阶段,稳定斑块和不稳定斑块组选取7个铁死亡相关蛋白(SLC1A5、AIFM2、BID、DPP4、TFR1、TF和GCLC),2个脂质代谢相关蛋白(APOA5、CETP)进行 IHC 分析。TFR1、TF、AIFM2、DPP4 和 GCLC 蛋白在不稳定斑块的纤维帽区域表达显著高于稳定组,SLC1A5,BID、CETP和APOA5蛋白的表达在不稳定斑块脂质核心区域表达显著高于稳定斑块,CETP无统计学意义。AHA Ⅳ、AHA Ⅵ型斑块组选取免疫及炎症相关蛋白(CD44、TREM2、IL-6R和GAL-1)和细胞增殖迁移相关蛋白(SMAD3)进行IHC分析,在AHA Ⅵ型斑块中表达显著升高的是CD44和TREM2,表达显著降低的是GAL-1、SMAD3和IL-6R,SMAD3无统计学意义。CD44和GAL-1蛋白表达集中于纤维帽区域,TREM2、SMAD3和IL-6R蛋白主要在脂质核心区域表达。研究结论:本研究利用DIA-MS定量蛋白质组学分析技术筛选蛋白,通过独立样本IHC技术进行实验验证,发现蛋白质SLC1A5、AIFM2、BID、DPP4、TFR1、TF、GCLC、CETP和APOA5的表达在稳定和不稳定的颈动脉斑块之间有明显差异,其中CETP与临床指标CRP之间存在明显相关性。在AHA Ⅳ、AHA Ⅵ型斑块中CD44、TREM2、IL-6R、GAL-1和SMAD3蛋白具有显著差异。因此,我们发现铁死亡、脂质代谢、免疫炎症和细胞增殖相关因素可能在影响斑块稳定性和斑块进展过程中发挥了重要作用,这为进一步了解斑块进展的相关分子机制研究提供了重要思路。