研究背景中风是一种严重威胁人类生命健康的疾病。在中风后,大多数死亡是由于神经损伤,心血管并发症是其第二大原因。缺血性中风(Ischemic stroke,IS)的占全球所有中风的71%,新近研究表明,IS也能够对心脏造成不同程度的损伤和功能障碍。这种现象可以在临床上表现为左室射血分数(LVEF)降低、收缩功能障碍和心电图异常,被称为“脑心综合征(Brain-heart Syndrome,BHS)”。BHS的主要参与机制仍需研究,目前已经普遍认为,它主要涉及直接的脑-心神经调节、基于HPA轴的神经-体液调节,以及血脑屏障破坏引起的全身免疫炎症反应。脑心通胶囊(Naoxintong capsule,NXT)源于清代王清任的补阳还五汤,由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁7种天然药材组成。赵步长教授基于此方,增加了动物药全蝎、水蛭和活血化瘀药丹参、牛膝、鸡血藤、桂枝、桑枝、乳香、没药等,共计16味药。NXT的开发沿用了补阳还五汤中益气活血法的理念,结合中医“脑心同治”的思想理念,旨在研制出一种辅助治疗心脑血管疾病的药物。NXT已被药品监管部门批准应用于心脑血管疾病的临床治疗。同时,临床和基础研究都已报道NXT在动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、急性冠状动脉综合征、冠状动脉微栓塞、心肌梗死、缺血性卒中、缺血-再灌注损伤等心血管疾病的多重保护作用。本研究旨在通过脑缺血动物模型的建立,探究心肌损伤的表型和机制以及NXT对其干预作用。研究内容1.采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)。随后,将大鼠随机分为四组,分别为假手术组(Sham)、MCAO 12 h(MCAO 后 12 h)、MCAO 24 h(MCAO 后 24 h)和 MCAO 48h组(MCAO后48 h)。在MCAO后,使用Zea-Longa评分对神经功能进行评价,采用TTC染色评估脑梗死面积。使用Vevo 3100进行超声心动检测。同时,取大鼠血清进行CK-MB、AST、cTnT和NT-proBNP水平检测。最后,制作大鼠心脏的石蜡切片,并进行H&E染色和Masson染色。2.采用超高效液相-三重四级杆质谱(UPLC-QQQ-MS),建立靶向分析方法,定量检测大鼠血清中谷氨酸、γ-氨基丁酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、高香草酸、5-羟吲哚乙酸、乙酰胆碱等9种神经递质的含量。并且将此方法用于检测大鼠心肌组织匀浆液中神经递质的含量。3.建立去甲肾上腺素诱导H9c2细胞损伤的体外模型。首先采用CCK-8法,确定去甲肾上腺素对H9c2细胞的造模浓度范围和脑心通方肠吸收液对H9c2细胞的安全浓度范围。其次用CCK-8评价去甲肾上腺素对H9c2细胞的损伤作用和脑心通方肠吸收液对其的保护作用。并采用荧光探针检测去甲肾上腺素诱导H9c2细胞钙超载和ROS水平,以及脑心通方肠吸收液的改善作用。4.采用线栓法,建立大鼠MCAO模型。大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、尼莫地平给药组(Nimodipine)、美托洛尔给药组(Metoprolol)和脑心通方给药组(NXT)。MCAO后,首先采用Zea-Longa评分进行神经功能学评分,采用TTC染色评价脑梗死面积。然后,取大鼠血清检测CK-MB、AST、cTnT和NT-proBNP的水平。并用大鼠心脏制作石蜡切片,并进行H&E染色、Masson染色和Tunel染色。进一步通过生化检测测定大鼠心肌组织中CAT和MDA的水平;通过免疫组织化学检测评价大鼠心脏中Bax、Bcl-2、Cytochrome C和Caspase-3的表达;通过ELISA检测大鼠心肌组织中β1-AR和AC的活力。最后,通过免疫组织化学、Western blot和RT-PCR检测大鼠脑部酪氨酸羟化酶(TH)的表达量。研究结果一.脑缺血后心脏损伤表型初探1.脑缺血后心肌酶升高:血清结果显示,MCAO后,大鼠血清中与心肌损伤相关的生物标志物出现不同程度的变化。具体而言,MCAO后不同时间点,血清AST含量均有所升高,其中24 h升高最为显著(P<0.0001)。MCAO后24 h血清CK-MB水平显著升高(P<0.01),12 h、48 h无显著升高(P>0.05)。相反,血清NT-proBNP水平在MCAO后24 h无显著性差异(P>0.05),但在MCAO后12 h和48 h有显著性差异(P<0.05)。MCAO后12、24、48 h血清cTnT含量均有升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.脑缺血后心肌出现病理损伤:心脏H&E及Masson染色结果显示假手术组细胞形态结构正常,细胞核清晰,心肌纤维排列整齐,胞浆染色均匀。MCAO后心肌细胞组织紊乱VP-16,细胞核形状不规则。可见肿胀松弛的心肌纤维和少量结缔组织增生,排列杂乱。此外,从H&E染色结果分析来看,心肌细胞横截面积有一定的增加,说明存在细胞肿胀和肥大。3.脑缺血后心脏出现功能障碍:常规超声心动图显示,大鼠在MCAO后,出现左心室射血分数(LVEF)降低,心输出量(CO)降低,左心室短轴缩短率(LVFS)未出现显著性差异,未出现心室壁变薄的情况。且MCAO后24 h时,LVEF和CO较之MCAO后12 h和MCAO后48 h更低,提示MCAO后24 h的心功能障碍更为明显。散斑跟踪超声心动图显示,MCAO后大鼠出现strain曲线的紊乱和time-to-peak的不一致性,提示出现心室收缩和舒张的局部不同步性。二.基于质谱的脑缺血后神经递质靶向分析1.脑缺血后血清神经递质出现异常:在MCAO后48 h内,血清中9种神经递质都有显著改变。对于DA,观察到MCAO后24 h DA升高,但无明显变化(P>0.05)。MCAO后12、24、48 h GABA水平显著降低(P<0.05)。相应地,作为产生GABA的前体,Glu水平在MCAO后12 h和24 h显著升高(P<0.001),然后在48 h恢复到正常水平。与AD表现出与Glu相同的变化不同,NA水平在MCAO后12 h、24 h和48 h显著升高(P<0.001)。HVA是儿茶酚胺的代谢产物,MCAO后12 h和24 h血清中HVA升高(P<0.05)。ACH在 24h和 48 h显著下降(P<0.05)。此外,5-HT在 MCAO 后 12 h、24 h和48 h均有升高(P<0.05),而其代谢物5-HIAA直到MCAO后24 h才出现上升趋势(P<0.05)。2.脑缺血后心肌组织神经递质出现异常:MCAO后24 h和48 h,心肌组织中DA显著升高(P<0.001);AD、NA在MCAO后12 h、24 h和48 h都显著升高(P<0.05);HVA在MCAO后12 h、24h和48 h都显著降低(P<0.05);ACH则在MCAO后12 h和48 h显著降低(P<0.05),在MCAO后24 h时无显著变化(P>0.05);GABA只在MCAO后24h时显著升高(P<0.05)。三.去甲肾上腺素诱导H9c2细胞损伤及和脑心通方干预研究1.去甲肾上腺素诱导H9c2细胞产生氧化应激和钙超载,并且可能依赖于β1受体介导的cAMP-PKA通路:CCK-8实验发现去甲肾上腺素不同浓度(50μg/ml、20 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5μg/ml 和 0.2μg/ml)能降低H9c2细胞存活率,其中10 μg/ml的造模浓度适合进行后续实验。使用10μg/ml的去甲肾上腺素进行造模后,给予美托洛尔(20 μg/mL)和H-89(20 μg/mL)能够提高细胞生存率。荧光探针检测发现造模后钙离子浓度和ROS水平显著升高,给予美托洛尔和H-89后均能降低心肌细胞钙离子浓度和ROS水平。以上结果表明,体外给予去甲肾上腺素刺激H9c2细胞后,可能通过β1受体介导的cAMP-PKA通路来导致心肌细胞产生氧化应激和钙超载。2.脑心通方肠吸收液对去甲肾上腺素诱导的H9c2细胞损伤具有保护作用:CCK-8实验表明,脑心通方肠吸收液浓度小于0.04 mg/mL时,H9c2细胞生存率在90%以上,因此脑心通方肠吸收液浓度小于0.04 mg/mL时,不会产生细胞毒性。CCK-8实验发现不同浓度脑心通方肠吸收液(80μg/mL、16μg/mL、3.2 μg/mL、0.64μg/mL、0.128Safe biomedical applications μg/mL、2.56*10-2 μg/mL、5.12*10-3 μg/mL、1.024*10-3 μg/mL)能够对去甲肾上腺素损伤H9c2细胞起到保护作用,并呈现浓度依赖性最佳浓度为80 μg/mL。荧光探针检测发现给予脑心通方肠吸收液能够降低去甲肾上腺素导致的H9c2细胞钙离子浓度和ROS水平的上升。四.脑缺血后心脏损伤机制及脑心通方干预作用研究1.脑缺血后,导致脑部儿茶酚胺合成增加并过量释放入血,进而激活β1受体导致心脏氧化应激和细胞凋亡:在MCAO后24小时,Longa神经功能学评分和TTC染色表明脑缺血后的脑部梗死。给予尼莫地平能改善脑损伤,美托洛尔不能改善脑损伤;生化和ELISA检测显示了血清中CK-MB、AST、cTnT和NT-proBNP的水平上升,给予尼莫地平、美托洛尔和酪氨酸羟化酶抑制剂(α-MPT)后能够回调;H&E染色表明出现心脏病理损伤,并且在给予尼莫地平、美托洛尔和α-MPT后能够减轻;Tunel染色表明出现心肌细胞凋亡;生化检测发现心肌组织中CAT水平降低、MDA的水平升高,给予美托洛尔能回调心肌组织中CAT和MDA的水平;免疫组织化学发现心脏中Bax、Cytochrome C和Caspase-3的表达水平升高、Bcl-2的表达水平降低;ELISA检测发现心肌组织中β1受体和AC的水平增加;免疫组织化学、ELISA、Western blot和RT-PCR检测发现脑部酪氨酸羟化酶(TH)的表达和含量均增加;质谱检测发现血清中的NA和AD水平升高,并且给予尼莫地平和α-MPT后能够下调,给予美托洛尔则不能。以上结果说明,脑缺血后导致脑部TH的表达增加,增加血清中NA和AD的水平,进而刺激心脏β1受体和AC,介Others抑制剂导心肌细胞氧化应激损伤和凋亡,从而导致心肌细胞损伤。2.脑心通胶囊可以同时通过抑制脑部儿茶酚胺合成和抑制心脏β1受体来减轻脑缺血导致的心脏氧化应激和细胞凋亡:Longa神经功能学评分和TTC染色发现脑心通方能改善脑损伤。对于脑缺血导致的心肌损伤,生化和ELISA检测发现脑心通方能降低血清CK-MB、AST、cTnT和NT-proBNP的水平;H&E染色发现脑心通方能降低心脏病理损伤;Tunel染色发现脑心通方可以降低心肌细胞凋亡;生化检测发现脑心通方能回调心肌组织中CAT和MDA的水平;免疫组织化学检测发现脑心通方能够回调心脏中Bax、Bcl-2、Cytochrome C和Caspase-3的表达水平;ELISA检测发现脑心通方可以降低心肌组织中β1受体和AC的水平。免疫组织化学、ELISA、Western blot和PCR检测发现脑心通方、尼莫地平和酪氨酸羟化酶抑制剂(α-MPT)可以降低MCAO大鼠脑部TH的表达。质谱检测发现脑心通方能降低血清中的NA和AD水平。以上结果说明,脑心通胶囊可以同时通过抑制脑部TH的表达,降低血清中的NA和AD水平,抑制心脏β1受体来减轻心肌氧化应激和细胞凋亡,从而缓解脑缺血导致的心脏损伤。研究结论1.大鼠脑缺血后出现心脏收缩功能障碍、心肌酶升高和心肌组织病理损伤。2.大鼠脑缺血后血清和心肌组织中神经递质水平出现紊乱,主要体现在儿茶酚胺和乙酰胆碱的异常。3.NXT可以通过改善心肌氧化应激水平、细胞凋亡和下调β1受体来改善脑缺血所致的心肌损伤;4.脑心通方可以通过降低脑部TH表达来降低脑部儿茶酚胺合成,从而缓解脑缺血所致的心肌损伤。综上,脑心通方可以同时改善脑缺血所致脑部儿茶酚胺合成增加和心脏氧化应激以及凋亡来同时缓解脑缺血所致的心肌损伤。