背景:肝脏具有再生能力,其受到损伤后可进行细胞的退分化和再分化。这一生理过程需要多种信号通路进行精确调节来实现。许多信号在肝再生的通路中起作用,如YAP通路参与了肝细胞的退分化,Wnt通路在再分化中发挥作用。过去的机制研究局限在2D培养细胞的模式,本文介绍了一种3D生物打印技术。该技术可以帮助验证2D平面培养中得到的结论从而得到更有意义的结果,同时可用于探究3D的细胞培养模式对于肝细胞退分化和再分化的效果。方法:本研究从小鼠Tamoxifen提取了小鼠原代肝细胞,并利用小鼠原代肝细胞以及3D生物打印技术制作小鼠原代肝细胞3D组织块。在对这一组织块的细胞标志物和细胞活性进行验证后分组培养这些3D组织块。对照组使用改良后的标准培养基,实验组使用比对照组多3mM的CHIR99021的实验培养基。组织块在培养第1、3、5、7、9、1 1、13天时裂解并提取RNA,使用转录组学方法,包括单细胞测序和实时聚合酶链式反应(RT-qPCR),来阐明肝功能、退分化、再分化等基因的表达情况。结果:从小鼠肝脏中成功提取得到小鼠原代肝细胞。利用3D生物打印技术,小鼠原代肝细胞3D组织构建成功,细胞存活率良好,肝细胞标志物染色结果满意。共收集了 14组小鼠原代肝细胞3D组织块的RNA以及2组小鼠原代肝细胞2D培养下的RNA。通过RT-qPCR对5个基因进行进一步验证,包括Alb、Cyr61、Myc、p53、Afp。Cyr61基因在2D培养中表达量显著高于3D培养(P=0.0137),其他各组间比较差异无统计学意义。利用单细胞测序,我们收集了三组细胞,分别是3D组织块、2D传代培养的小鼠肝细胞和刚分离未传代的小鼠肝细胞,共检测了 10个基因,包括Alb、Cyp2d26、Hnf4a、Ctgf、Sox9、Krt19、Afp、Myc、Pml。我们发Amperometric biosensor现三组细胞在肝功能相关基因的表现差距不明显,刚分离未传代的小鼠肝细胞表现出较强的退分化、YAP通路信号的激活,而2D传代培养的小鼠肝细胞表现了更多的肝前体细胞标志物,3D组织块则缓和了这些激活后的通路。结论:本研究首次将3D生物打印技术应用于细胞机制层面的研究。首先我们建立了一个稳定高效的原代小鼠肝细胞系,这一细胞系对于未来的细胞研究有极大的启示作用。其次,本研究着眼于肝细胞退分化和再分化潜能的研究,这对于肝再生的机制的了AMG510生产商解和未来人工肝的实现有极大意义。根据转录组学的结果,肝细胞的去分化过程开始于肝细胞从动物中分离,此时YAP通路激活,在持续的2D传代培养中肝细胞转化为肝前体细胞。3D生物打印技术改变了细胞的生长环境,使退分化后的肝细胞逐步开始再分化。实验过程中整个组织能够维持一定的肝功能表达。同时,肝脏的再生过程依旧需要更多的研究来阐明,这可能为肝脏的不典型增生疾病的药物设计提供一个新的思路。