克氏原螯虾(Procambarus clarkii)具有环境适应性强、食性杂的特点,能充分利用稻田环境中丰富的天然动植物饵料。纤维素酶是指能够水解纤维素的一类糖苷水解酶,包括多种协同工作的酶类,能够有效降解植物细胞壁及多糖等,对杂食及草食性动物的消化代谢至关重要。糖苷水解酶第9家族(Glycoside hydrolases family 9,GH9)基因编码的纤维素酶在甲壳动物中广泛分布,但研究仍局限于克隆、序列分析及初步酶学功能探究。本实验室前期研究表明克氏原螯虾基因组中存在大量GH9基因并发生基因家族复制事件,但对于该家族基因在克氏原螯虾消化过程中的功能,以及相关基因复制对克氏原螯虾影响尚不清楚。本研究深入研究克氏原螯虾GH9家族(PcGH9)的分子特征、系统发育及其酶学性质,解析克氏原螯虾GH9家族基因演化和功能特征。主要结果如下:1、PcGH9的克隆及生物信息学分析根据本实验室克氏原螯虾基因组序列分析结果,克隆得到9个PcGH9基因,其开放阅读框长度为913～1734 bp,编码氨基酸数目范围为304～578个。PcGH9蛋白具有典型的GH9催化结构域。其中,PcGH9＿1的N-端包含一个碳水化合物第2家族结合结构域(Carbohydrate-binding module family 2,CBM＿2),PcGH9＿3的N-端含有一个丝氨酸蛋白酶原肠胚胎化缺陷N-末端结构域,而PcGH9＿4和PcGH9＿10的GH9结构域不完整,缺失了关键的催化位点和保守基序。因此,这些不同蛋白间的结构域差异可能是家族基因在进化过程中发生重组和复制所产生,可能增加了PcGH9蛋白功Periprostethic joint infection能的多样性。系统发育树构建结果表明甲壳动物GH9基因独立成一支,与昆虫类形成姊妹群,克氏原螯虾的PcGH9在甲壳动物支内。2、PcGH9在植物消化过程中的表达分析荧光定量PCR结果显示持续投喂植物性饵料的克氏原螯虾体内PcGH9表达量显著高于持续投喂动物性饵料的克氏原螯虾(P<0.05),说明这几种PcGH9可能参与克氏原螯虾消化利用植物性饵料的过程并发挥重要作LGK-974配制用。3、PcGH9＿1、PcGH9＿4、PcGH9＿12和PcGH9＿13的原核表Antineoplastic and I抑制剂达及活性验证本研究构建了PcGH9＿1、PcGH9＿4、PcGH9＿12和PcGH9＿13的重组表达质粒,分别将它们导入BL21(DE3)大肠杆菌宿主中,成功诱导表达出相应的重组蛋白。DNS法检测发现p ET-30a-PcGH9＿1可溶性蛋白具有内切葡聚糖酶活力,活力为0.194 U/m L,而p GEX-4t-1-PcGH9＿4和p ET-32a-PcGH9＿13的可溶性蛋白以及p ET-28a-PcGH9＿12包涵体复性蛋白没有活性。4、PcGH9＿1的蛋白纯化及酶学性质研究本研究优化了活性重组蛋白p ET-30a-PcGH9＿1的诱导条件,发现p ET-30a-PcGH9＿1重组蛋白在600 nm处初始诱导OD值为1.1,诱导温度为16℃,且诱导16 h后,其可溶性蛋白表达量最高。将p ET-30a-PcGH9＿1可溶性蛋白分别经过镍柱亲和层析和阴离子交换层析纯化,获得高纯度的酶蛋白。以羧甲基纤维素钠为底物的酶活性研究发现,PcGH9＿1参与酶促反应的最适p H为5.5,最适温度为55℃,55℃孵育3 h后保留62.92%的相对酶活力,Mn~(2+)和Fe~(2+)分别能极显著提高181.75%和159.45%的内切葡聚糖酶活性(P<0.001),而Cu~(2+)极显著抑制内切葡聚糖酶活性(P<0.001),仅保留32.70%活性。除此之外,PcGH9＿1能水解羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、山毛榉木来源的木聚糖、角豆胶和苹果果胶5种底物,比活力分别为1.32±0.03、1.32±0.04、1.26±0.02、0.71±0.09和0.33±0.05U/mg,但不能降解对-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷。这些结果表明PcGH9＿1是一个具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、甘露糖聚酶和果胶酶降解特性的多功能酶。综上,本研究发现克氏原螯虾GH9基因家族基因可能通过基因重复等方式发生了新功能化并参与了克氏原螯虾消化利用植物性饵料的过程;PcGH9＿1具有五种降解酶特性的多功能酶。研究结果解析了克氏原螯虾GH9家族序列特点、蛋白结构和功能,初步揭示了克氏原螯虾利用天然植物饵料的机理。