L-苏氨酸属于人体九种必需氨基酸之一,广泛应用于饲料、食品、医药等领域。随着对大肠杆菌(Escherichia coli)中L-苏氨酸合成机制的深入了解,基于代谢工程改造大肠杆菌生产L-苏氨酸受到各国学者的青睐。大肠杆菌生物合成L-苏氨酸的代谢途径包括Z-VAD-FMK小鼠:葡萄糖糖酵解、三羧酸循环和L-苏氨酸合成。本研究以大肠杆菌菌株XQ-12为出发菌株,结合CRISPR-Cas9基因编辑技术,分析L-苏氨酸合成途径中的关键酶的反馈抑制作用、优化代谢途径中关键基因、减少支路代谢等系统代谢工程策略,逐步提高L-苏氨酸的产量。主要研究结果BIBW2992体内实验剂量如下:(1)调控主要代谢途径:结合CRISPR-Cas9基因编辑技术,用较强的Ptrc启动子取代thrA天然启动子,并在假基因位点rpnD增加其在XQ-12基因组上的拷贝数增加L-天冬氨酸向L-苏氨酸的代谢通量。与原菌株XQ-12相比,菌株XQ-12.1在摇瓶发酵中的L-苏氨酸产量增加了 0.4倍(从9.5 g·L-1到13.2 g·L-1)。(2)增加前体物质合成:为了增加草酰乙酸的供应,在菌株XQ-12.1中过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc。观察到菌株XQ-12.1/pEC-XK99E-ppc产量有所下降后,用Ptrc启动子替换基因ppc的天然启动子,构建XQ-12.1 Pmilk-derived bioactive peptideppc::Ptrc菌株,即菌株XQ-12.2。菌株XQ-12.2的L-苏氨酸产量比XQ-12.1高6.8%,达到14.1 g·L-1,进一步提高了 L-苏氨酸产量。(3)减少碳源溢流:对糖酵解途径进行改造,对其关键酶基因pfkA和pykF进行基因敲除,获得菌株XQ-12.3。摇瓶发酵菌株XQ-12.3的L-苏氨酸产量(19.3 g·L-1)明显高于菌株XQ-12.2(14.1g·L-1)。在菌株XQ-12.3基因组中敲除基因crr,摇瓶发酵观察乙酸生成量及L-苏氨酸产量。敲除L-苏氨酸分解途径的关键基因tdh,获得菌株XQ-12.4。通过摇瓶发酵,菌株XQ-12.4的L-苏氨酸产量达到23.8 g·L-1。(4)发酵条件优化:在单因素实验的基础上,使用Box-Behnken Design(BBD)进行响应面设计优化培养基组分,得到菌株XQ-12.4发酵培养基成分的最佳参数水平;对菌株XQ-12.4发酵条件进行优化,获得最佳培养条件:pH 7.1、种龄14 h、接种量8%。(5)5 L发酵罐培养:对重组菌株XQ-12.4在上述优化条件下进行5 L发酵罐补料分批发酵。发酵结果显示,发酵36 h后,菌株XQ-12.4的L-苏氨酸产量达到131.20 g·L-1,产率为 3.64 g.L-1·h-1。本研究对L-苏氨酸生产菌株进行代谢改造以及发酵条件的优化,提升了菌株的产L-苏氨酸能力,对工业化生产L-苏氨酸具有一定的参考意义。