目的考察和评价荷叶碱对MCAO脑缺血模型大鼠及氧糖剥夺PC12细胞的神经保护作用,从G3BP1介导的应激颗粒角度,进一步探讨其神经保护的作用机制。方法1.文献研究利用中国知网(CNKI)、美国国立医学图书馆网络数据库(PubMed)、科睿唯安数据服务平台(Web of Science)、谷歌(Google)等文献数据库和搜索引擎为主要工具,以荷叶碱(Nuciferine)、中风/卒中(stroke)、缺血(ischemia)、应激颗粒(Stress granule)、G3BP1、神经保护(Neuroprotective/Neuroprotection)、MCAO(Middle cerebral artery occlusion)、OGD(Oxygen glucose deprivation)、TCM(Traditional Chinese Medicine)等为检索关键词,对脑缺血的病理过程、中药的作用机制、卒中的动物模型、神经保护剂的开发、应激颗粒的形成与解聚、应激颗粒的功能、荷叶碱的理化性质及药理作用机制等方面进行了系统的文献梳理和分析,以期为本研究具体的实验设计和开展提供思路和参考。2.荷叶碱对脑缺血大鼠的保护作用研究选择230-260g的SD大鼠,分为假手术组(sham)、模型组(vehicle),阳性药组(EGb 761,100 mg/kg),荷叶碱低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量组。除假手术组外,其余各组均采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。整体药效层面上,Zea-longa五级评分法评价各组大鼠的行为学功能,TTC染色法评价梗死体积,通过对左右脑组织的称重评价其水肿率,并考察各组动物造模后一周内的死亡情况以评价荷叶碱对模型动物生存率的影响。形态学上,苏木精伊红(HE)染色法评价脑组织的病理损伤情况,尼氏染色和Neun免疫组化法评价脑组织中神经元细胞的损伤情况,Tunel和Cleaved Caspase-3免疫组化法评价脑组织中的细胞凋亡情况。采用酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒或免疫组化法,对血清或脑组织中的TNF-α、IL-1β、NF-kB p65及总抗氧化能力(T-AOC)、GSH/GSSG、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等炎症与氧化应激指标进行了考察,以评估荷叶碱的抗炎及抗氧化的能力。3.荷叶碱抗脑缺血的作用特点及趋势研究本研究采用血清代谢组学和TMNP的研究策略,对荷叶碱抗脑缺血的作用特点进行了研究。代谢组学研究实验将大鼠分为6个实验组,术后24 h腹主动脉采血,离心取血清,经预处理后进行NMR检测。检测方法选择~1D CPMG-presat模式,并采用MestReNova软件进行基线校正及相位调整,面积归一化法对检测数据进行归一化处理。SIMCA-P软件对归一化数据进行进一步的主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析,并结合SPSS软件对差异代谢物进行筛选。采用Chenomx NMR Suite database、Human Metabolome Database、KEEG、Metabo Analyst、Met Scape及Cytoscape 3.7.1数据库和软件对差异代谢物进行进一步的鉴定和代谢网络构建。根据网络构建结果得到调控这些差异代谢的关键酶,采用PCR检测方法考察这些关键酶在mRNA水平上的表达。TMNP的研究是基于大鼠MCAO模型,将实验动物分为假手术组、模型组及荷叶碱(40 mg/kg)给药组,术后24 h取大脑皮层半暗带组织,提取mRNA并进行转录组测序。采用TMNP方法,首先分别从UCSC Xena数据库、Cellmarker数据库、Medical Subject Headings(MeSH)结合Pub Med文献数据库、基因本体(GO)数据库、京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中,提取并建立在组织、细胞、病理过程、生物过程、信号通路5个维度上的基因标签信息,再通过关联算法计算荷叶碱诱导的转录图谱,与上述建立的5个维度上的基因标签之间的相似度,即可推断荷叶碱抗脑缺血可能的作用特点和趋势。4.荷叶碱抗脑缺血的作用靶点研究本部分研究内容主要分为基于TMNP的靶点预测、分子对接(Docking)、细胞热转变分析(CETSA)、药物亲和反应的靶点稳定性(DARTS)及生物膜干涉(BLI)五部分。基于TMNP的靶点预测方法首先依托于Connectivity Map数据库,构建靶点的基因标签,再通过关联计算得到荷叶碱可能的靶标信息。Docking研究部分是从数据库中下载了荷叶碱和G3BP1的结构式,经过预处理后,采用Auto Dock软件进行分子对接。CESTA及DARTS实验的考察,首先提取得到细胞的总蛋白,加入一定浓度的荷叶碱(30/60μM),经孵育后,分别在PCR仪中进行梯度加热(37,45,53,61,69,77,85℃)或加入一定浓度的链霉菌蛋白酶,以热解或酶解蛋白,常规western blot法评价荷叶碱对G3BP1热耐受性和酶解耐受性的影响。BLConus medullarisI实验部分主要采用生物分子相互作用仪,获取荷叶碱与G3BP1及其NTF2结构域的结合和解离信息,并通过仪器自带的分析软件进行数据分析,得到荷叶碱与蛋白结合的动力学参数。5.荷叶碱对应激颗粒形成的研究本部分研究采用MCAO大鼠模型和氧糖剥夺的PC12细胞模型分别予以考察。在动物水平上,采用免疫组化法,以G3BP1及TIA1为应激颗粒的标记蛋白,首先评价了荷叶碱是否可以促进脑缺血组织中应激颗粒的生成。在此基础上,采用免疫荧光法,考察了G3BP1和神经元细胞标记Neun、星形胶质细胞标记GFAP及小胶质细胞标记Iba-1的共定位的情况,以评估应激颗粒主要形成于哪种细胞类型,并进一步评价荷叶碱组与模型组脑组织中G3BP1与细胞标记的共定位强度。细胞水平上,采用MTT法首先考察了荷叶碱的安全剂量范围,并在此基础上采用MTT法及Calcein/PI双染,评价了荷叶碱对氧糖剥夺PC12细胞的细胞保护作用。进一步,本研究还采用了si RNA干扰技术,考察了G3BP1基因沉默后,荷叶碱对细胞保护作用的影响。最后,采用免疫荧光共定位的方法,对不同组别的神经细胞进行了G3BP1聚集情况的考察,以评价荷叶碱在细胞水平对应激颗粒的影响。结果1.文献研究广泛而深入的文献研究发现,缺血性脑卒中严重威胁人类健康,临床上对创新型的神经保护药物有着迫切的需求。G3BP1介导的应激颗粒是细胞遭受不利环境刺激下形成的一种亚细胞结构,在调节肿瘤和病毒感染等领域均发挥了重要作用。近年来的研究发现,应激颗粒的形成可抑制脑缺血后神经细胞的凋亡,对其他神经退行性疾病也有着重要的调节作用,这给创新型神经保护剂的开发提供了新的思路和视角。荷叶碱具有明显的抗脑缺血作用,机制涉及抗炎、抗氧化、舒张血管、阻断L-谷氨酸等,但荷叶碱的抗脑缺血作用是否通过应激颗粒来介导,目前尚不清楚。2.荷叶碱对脑缺血大鼠的保护作用研究与假手术组比,模型组出现了明显的神经行为学障碍,TTC染色结果也可以看到一侧脑组织有明显的白色缺血区域,并出现了严重的脑水肿,HE病理结果显示,缺血侧组织有明显的病理损伤,表明动物造模成功。与模型组比,荷叶碱给药组(40 mg/kg)的神经行为学评分及水肿率显著降低(p<0.01),脑梗死体积明显缩小(p<0.05),并可一定程度上延长缺血大鼠的存活时间。此外,荷叶碱(40 mg/kg)还可减轻缺血导致的脑组织病理损伤,降低Tunel和Cleaved Caspase-3阳性细胞数量(p<0.01),升高Nissl和Neun阳性细胞数量(p<0.01),降低脑组织或血清中MDA、IL-1β及TNF-α含量(p<0.05或p<0.01),减少脑组织中IL-1β及NF-kB p65的阳性细胞数(p<0.05或p<0.01),提高总抗氧化能力(T-AOC)、GSH/GSS比例及SOD活性(p<0.05或p<0.01)。这些结果提示,荷叶碱具有明显的抗脑缺血作用,该作用或与抗炎、抗氧化及抑制细胞凋亡有关。3.荷叶碱抗脑缺血的作用特点及趋势研究通过血清代谢组学的研究,在血清中共检测到39个内源性小分子代谢物。PCA的分析结果表明,各组的聚类得到了良好的分离,且荷叶碱给药组位于模型组和假手术组之间,提示荷叶碱具有改善缺血导致的内源性小分子紊乱的作用。通过进一步分析,共有19个差异代谢物被识别,与模型组比,荷叶碱干预后精氨酸,异亮氨酸,谷氨酸,鸟氨酸,组氨酸,二甲基甘氨酸,甜菜碱,甘氨酸,谷氨酰胺,葡萄糖,甘油,肌酸,丝氨酸,尿素,酪氨酸共15种代谢物显著升高,4种代谢物包括乳酸,赖氨酸,苏氨酸,胆碱显著降低。这些差异代谢物可富集到9个核心的代谢通路并与15个关键代谢酶有关。通过对差异代谢物、代谢通路及代谢酶的综合分析,发现荷叶碱对内源性小分子代谢物的综合调节,主要与干预脑缺血后的兴奋性毒性、炎症、氧化应激等生物和病理过程有关。另外,本研究还采用TMNP实验方法,建立了31个组织、2431个细胞、437个病理过程、5864个生物过程及345个信号通路的特异性基因表达谱。转录组数据的聚类热图和PCA结果PLX5622试剂显示,各样本在组内差异较小,组间差异明显。差异基因分析结果显示,共667个基因的表达发生了逆转,这些差异基因可显著富集到mRNA surveillance pathway、response to endogenous stimulus等应激相关通路,divalent metal ion transport、calcium ion transport等金属离子转运等25个信号通路及52个生物过程。TMNP关联分析结果表明,荷叶碱在组织水平上对脑和脾,细胞水平上对星形胶质细胞和神经祖细胞有着较好的逆转作用,对inflammatory response、necrosis、response to cytokine等免疫与炎症等过程,serotonergic synapse、axon guidance、synaptic signaling等神经突触相关过程以及血管重构生物过程blood vessel morphogenesis、angiogenesis、blood vessel development等均有明显的调节作用。TMNP的研究结果提示,荷叶碱有可能通过调节中枢脑或者外周脾介导的多个免疫和炎症生物过程,发挥脑缺血后的神经保护作用。4.荷叶碱抗脑缺血的作用靶点研究本研究中,首先通过TMNP策略,构建了4540个基因靶标的特异性基因表达谱,并通过关联计算,将荷叶碱的潜在靶点聚焦到打分最高的G3BP1。随后再分子对接技术,发现荷叶碱与G3BP1的结合能为-9.4 kcal/mol。CETSA研究表明,随着温度升高,G3BP1蛋白条带信号明显减弱,但相对于阴性对照组,荷叶碱(60μM)预孵育组在温度高于61℃时,蛋白条带信号明显更高(p<0.05或p<0.01)。DARTS实验也发现,与链霉菌蛋白酶组比,荷叶碱(30/60μM)预孵育组的蛋白条带信号显著增强(p<0.05或p<0.01)。BLI实验结果显示,荷叶碱与G3BP1及其NTF2结构域均有良好的结合能力。这些研究结果提示,荷叶碱可能与G3BP1蛋白的NTF2结构域相结合,进而发挥生物学功能。5.荷叶碱对应激颗粒形成的研究大鼠脑组织缺血半暗带的免疫组化结果表明,与假手术组比,模型组中TIA1和G3BP1阳性细胞数显著增加(p<0.01),与模型组比,荷叶碱(40 mg/kg)组中TIA1和G3BP1的阳性细胞数进一步增加(p<0.01),各组之间G3BP1的变化趋势相对于TIA1更为明显。免疫荧光共定位实验显示,G3BP1主要与神经元细胞标记Neun存在共定位,且相比较于模型组,荷叶碱(40 mg/kg)组中存在荧光共定位的细胞数更多。细胞实验显示,荷叶碱(60μM)可显著提高OGD诱导PC12细胞中含有应激颗粒的细胞数量(p<0.01)和细胞活性(p<0.01)。然而MTT获悉更多结果显示,荷叶碱促进PC12细胞存活的作用,在si RNA-G3BP1后被明显抑制(p<0.05)。本研究结果提示,脑缺血后应激颗粒主要在神经元细胞中形成,而荷叶碱可增加MCAO大鼠脑组织及氧糖剥夺的PC12细胞中应激颗粒的数量,体外细胞实验也证实了其神经保护作用是通过应激颗粒介导的。结论荷叶碱可改善局灶性脑缺血大鼠的神经行为学功能,缩小脑梗死体积,降低脑水肿率,减轻缺血脑组织的病理损伤,具有明显的抗脑缺血作用。该作用与促进G3BP1介导的应激颗粒形成,干预免疫及炎症反应,调节氧化应激等状态有关。