研究目的:运动疲劳是指机体在运动过程中不能持续在一特定水平和/或不能维持预定的运动强度。随着竞技体育技术的发展,适宜的运动疲劳也日益成为运动员成绩提高的必要过程之一;运动可提高机体的氧化应激水平,研究表明力竭运动时机体会产生过多的自由基(ROS),氧化应激水平提高,产生大量不稳定的强氧化性物质,包括O2-、过氧化氢和羟自由基(-OH)等。缓解运动疲劳、延缓运动疲劳的产生,一直是科研人员研究的热点。工业大麻是指神经致幻成瘾毒性成分THC(四氢大麻酚)含量低于0.3%的大麻,不能作毒品提取原材料;CBD(cannabidiol,大麻二酚)是工业大麻中大麻素类成分之一,是一种氧化剂和神经保护剂,同时具有一定的抗炎效果,且不具有成瘾性;研究表明,CBD对机体炎症反应和氧化应激反应具有较好的修复功能。现在关于CBD剂量对运动疲劳产生氧化应激作用机制较少。本研究探讨不同浓度CBD对运动疲劳大鼠骨骼肌中氧化应激反应的影响,明确适宜的CBD干预浓度。为大麻二酚干预运动疲劳提供科学理论依据,以期为CBD在医药、食品和保健品行业的应用提供理论支撑。研究方法:本研究选取36只SPF级雄性SD大鼠,体重为165-200g。所有动物分笼饲养,室温维持在22±4℃,光照按照自然环境给予。在动物饲养期间,所有大鼠自由摄入食物和水。随机进行分组,每组选取6只大鼠,分组设置为:空白对照组(CK),运动椰子油组(YZ)、运动对照组(DZ)、运动50mg/kg组(50)、运动60mg/kg组(60)、运动70mg/kg组(70)。适应性训练后,构建渐增负荷游泳运动大鼠疲劳模型,共计运动9天。具体游泳方案如下:第1-2天,分别游泳30min,第3天游泳60min,第4天游泳90min,第5天游泳120min,第6天游泳150min,第7天游泳180min,第8天游泳190min,第9天200min到力竭。在运动疲劳造模结束后对灌胃组大鼠进行不同浓度CBD灌胃。在运动疲劳造模的最后一天,对运动各组大鼠运动力竭时间进行记录。抽取血液,制备血清样品,左侧腓肠肌用10%固定液固定,用作透射电镜成像;右侧腓肠肌利用液氮速冻,保存于-80℃冰箱,用于后续试验。(1)利用透射电子显微镜对不同组别大鼠骨骼肌组织超微结构进行观察。将骨骼肌组织从戊二醛固定液中取出,首先用0.1mol/L的磷酸缓冲液冲洗,再用体积分数为1%的锇酸固定,然后用0.1mol/L的磷酸缓冲液再次冲洗,之后进行脱水处理(乙醇溶液的体积分数为50%、70%、90%、100%),然后用环氧树脂将其包埋,再将其纵切制成超薄切片,待样品干燥后采用透射电镜观察线粒体的超微结构。(2)用比色法检测大鼠血清中SOD、CAT和GSH-Px酶的含量,按南京建成试剂盒说明书对各组大鼠血清中CAT、SOD、GSH-Px含量进行测定。了解不同浓度CBD对运动疲劳大鼠血清中氧化应激反应的影响。(3)运用qPCR技术对大鼠骨骼肌中氧化应激相关基因SOD、CAT和GSH-Px表达情况进行分析,将骨骼肌样本剪碎放入TRIzol溶液,按照全式金试剂盒说明书操作提取RNA。符合标准的RNA按说bioactive glass明书反转录为c DNA。使用NCBI网站设计引物,引物序列详见表2。使用两步法对c DNA产物进行扩增,退火温度设计为58℃,扩增次数为40次。GAPDH基因表达量和对照组基因表达量分别作为内对照和参考。所有样本均三次重复。采用SPSS 19.0软件对实验数据进行ANCOVA检验,生物复制三个相对量的平均值采用Students检验,95%置信水平(P<0.05)确定基因表达显著性。摸清不同浓度CBD对运动疲劳大鼠血清中氧化应激反应相关基因的表达情况。(4)用Western blot检测不同浓度CBD干预下运动疲劳大鼠骨骼肌AMPK、PGC1-α蛋白表达。通过以上研究找寻适宜的CBD浓度对运动疲劳大鼠干预较好的效果。研究结果:CBD可以帮助加速运动疲劳恢复,在不同剂量的干预中呈现量效关系。在70mg/kg的干预下,最后一次力竭运动时间高于60mg/kg(P<0.05),50mg/kg(P<0.05)。(1)不同剂量CBD对运动疲劳大鼠骨骼肌微细结构影响结果显示,经过CBD干预后,肌节完整、线粒体正常,并且70组明显好于60组与50组,在没有CBD干预的组别中GSK1349572,呈现Z线扭曲,线粒体肿胀等。(2)不同剂量CBD对运动疲劳大鼠血清氧化应激相关指标影响的结果显示,药物剂量与氧化应激水平呈反比,SOD、GSH-Px、CAT水平与药物剂量呈正比,运动疲劳使大鼠骨骼肌中SOD显著降低(P<0.05或P<0.01)。经过CBD干预后血清SOD明显升高(P<0.05或P<0.01),并且呈现剂量递增效应。CBD可改善氧化应激造成的CAT下降(P<0.05或P<0.01)。CBD可以增加血清GSH-Px表达(P<0.05)。(3)对不同剂量CBD对运动疲劳大鼠骨骼肌氧化应激相关基因表达分析显示,与血清氧化应激研究结果类似,CBD干预的组别中SOD分泌增加(P<0.05)在与50组比较中,70组呈极显著增加(P<0.01)。CBD可以显著改善氧化应激导致的GSH-Px减少,在CBD干预的组别中,GSH明显高于YZ组(P<0.05),70组呈现极显著差异(P<0.01)。CBD可以提高CAT基因表达量,在70组相比较于DZ组(P<0.01)显著提升了CAT基因表达量。同时运动导致GSH-Px显著降低(P<0.05)。(4)对不同剂量CBD对运动疲劳大鼠骨骼肌中AMPK、PGC1-α蛋白的影响检测结果,寻找更多表明在进行运动疲劳干预后,运动大鼠的AMPK、PGC1-α蛋白表达提升,而经过CBD干预后,AMPK和PGC1-α表达显著提升(P<0.05),与50组相比70组AMPK、PGC1-α蛋白表达明显升高(P<0.05),与DZ组相比70组AMPK、PGC1-α蛋白表达量呈现极显著升高(P<0.01)。研究结论:1.CBD可以保护运动疲劳大鼠骨骼肌超微结构免受损伤。2.CBD可以改善疲劳大鼠骨骼肌中氧化应激情况,并且呈现剂量递增效应。