2.1不同区段小肠类器官培养
肠道组织的动态平衡是肠道行使各项功能的基础， 肠道中的组织平衡需要位于肠隐窝底部的干细胞在自我更新和分化形成子代祖细胞之间保持动态平衡来调节， 祖细胞进一步分化产生所有成熟肠道细胞类型，包括潘氏细胞、杯状细胞、内分泌细胞及吸收细胞等[21]。 因此，肠道干细胞或含有肠道干细胞组织的分离是实现肠道类器官体外培养方法建立的前提。 由于单GDC-0068使用方法个肠道干细胞分离需要借助特殊标记肠道干细胞的转基因小鼠及流式细胞分选方法，试验成本高，因此本研究以含有肠道干细胞的小肠隐窝为对象， 优化了不同区段小肠隐窝的分离方法， 大大缩短隐窝分离所需时间，从小鼠组织获取到隐窝分离所需时间少于 25 min， 与已报道的方法相比时间缩短了 1~2 倍[22]。另外此方法还提高了隐窝分离纯度和类器官生成率，如图 2a~2c 所示，十二指肠、空肠和回肠均可获得纯度>80%的隐窝，新分离小肠隐窝呈典型的U 型结构。
分离的小肠隐窝经过数小时到 1 d 培养形成闭合的囊状结构（如图 2m），位于小肠隐窝底部的干细胞向囊状结构四周扩增， 经过增殖与分化过程， 培养第 3~5 d 闭合囊状结构转变为具有多个向外凸起芽体的立体结构（如图 2d~2f 和 2m），即形成典型的小肠类器官结构， 而且不同区段小肠具有相似生长特征， 本方法获得的类器官的生长特性与 Sato 等[6]报道的生长特性一致，然而成熟类器官结构形成速度更快， 这可能来自于培养基及成分的差异性。 另外，在培养过程中随着培养时间增加类器官形成的芽体数量也不断增加selleck NMR， 由于每个芽体都能独立成长形成新的肠道类器官， 所以芽体被认为是小肠隐窝的类似结构， 并且 Fuller等[23]提出类器官出芽个数的多少可作为类器官生长能力和分化能力的重要评价指标， 本文建立的类器官培养方法可以很好的保留来源于肠道组织中肠道干细胞的增殖分化特征。 图 2g~2i 结果证实， 小肠类器官经传代后芽体从类器官结构中解离出来， 经过 2 h 培养后与原代隐窝培养形成闭合的囊状结构， 同时经过 3~5 d 培养形成典型类器官结构（如图 2j~2l）。 与以往的组织体外研究模型相比，以肠道干细胞为基础的类器官培养，具有可传代性， 而且经过多次传代后类器官仍保持相同的生长特性 （如图 2g~2l）， 具有表型结构稳定性。E7080
2.2小肠类器官再现体内肠道上皮结构特征及细胞组成
肠道上皮是一个多细胞组成结构， 除了位于隐窝底部的肠道干细胞外， 肠上皮细胞主要包括2 大类：吸收细胞和分泌细胞。 分泌细胞主要包括杯 状细胞 、 潘 氏 细胞 、 内 分 泌细胞和簇状细胞等[24]。 每种类型细胞具有特定的基因和蛋白构成，行使特定的功能，与非肠道上皮细胞相比，肠道上皮细胞普遍表达钙黏蛋白（E-cadherin）；肠道内分
泌细胞表达有嗜铬粒蛋白 A （Chramogrin A，Chr- A）， 肠道内分泌细胞包括表达有胰高血糖素样肽-1 （GLP-1）的 L- 型细胞，表达有抑胃肽（GIP）