丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pFer-1体内ogona)经好氧发酵产生的具有杀虫活性的次级代谢产物。利用基因组学技术和anti SMASH分析,发现须糖多孢菌包含32个次级代谢产物基因簇,其编码的代谢物产生竞争性干扰。因此,通过删除其他非必需基因簇来减少代谢竞争,促进丁烯基多杀菌素的生物合成是一种可行的研究策略。然而,须糖多孢菌具有复杂的遗传背景和代谢网络,从其基因组中筛选可以精简和优化的目标基因簇是一个巨大的挑战。本研究利用CRISPR/Cas9技术,对须糖多孢菌的三个非靶标聚酮化合物基因簇进行敲除,成功构建了S.pogona-Δclu4、S.pogona-Δclu13和S.pogona-Δclu22三株工程菌。HPLC分析表明,S.pogona-Δclu13表现出较强的丁烯基多杀菌素生产能力,其产量相比于野生型须糖多孢菌提高了4.06倍。为了研究S.pogona-Δclu13促进丁烯基多杀菌素生物合成的原因,分析了基因簇clu13中的52个编码基因,发现其包含一个聚酮合酶RppA-L的编码基因,推测其能竞争性利用辅酶A前体,从而干扰丁烯基多杀菌素的生物合成。通过工程菌S.pogona-ΔrppA-L的构建,证实了rppA-L的缺失促进了丁烯基多杀菌素的生物合成,但是增幅不大,说明该基因不是影响丁烯基多杀菌素生物合成的主要原因。分析了基因簇clu13中所有基因的转录丰度后,发现其中包含了一个潜在的调控因子Sp1764,其在基因簇clu13中具有较高的转录丰度。在须糖多孢菌中抑制了sp1764的基因表达后,丁烯基多杀菌素的产量相比野生型菌株提高了3.15倍,说明该基因的缺失是S.pogona-Δclu13中引起丁烯基多杀菌素产量提高的主要原因。对野生型须糖多孢菌和S.pogona-Δclu13进行了差异蛋白质组学分析,从中鉴定到一系列参与生长发育和丁烯基多杀菌素生物合成调控的基因发生了表达变化。为了优化丁烯基多杀菌素生物合成代谢网络,对差异表达的蛋白进行了深入分析,发现较多影响丁烯基多杀菌素生物合成的蛋白与氨基酸代谢相关,此外,还有一系列潜在的调控因子也发生了表达变化。本研究首先对蛋白质组中鉴定的潜在调控因子Reg和表达下调的生物素羧基载体蛋白BccA进行了研究,将这两个蛋白在野生型须糖多孢菌中进行了过表达。结果显示,S.pogona-Reg和S.pogona-BccA中丁烯基多杀菌素的产量相比野生型菌株分别提高了2.16倍和0.77倍。上述结果表明,蛋白质组学数据能有效鉴定调控丁烯基多杀菌素生物合成的调控因子,同时也证实了氨基酸代谢与丁烯基多杀菌素生物合成具有密切的联系。KEGG分析表明,氨基酸降解能够合成丁烯基多杀菌素所需的辅酶A前体。除了BccA,根据蛋白质组学还筛Drug incubation infectivity test选出了潜在调控丁烯基多杀菌素生物合成的两个蛋白MmsA(丙二酸半醛脱氢酶)和PaaF(烯酰-Co A水合酶),分别构建了2株过表达工程菌S.pogona-MmsA和S.pogona-PaaF。结果表明,S.pogona-MmsA中丁烯基多杀菌素产量相比野生型菌株提高了0.84倍,但是S.pogona-PaaF中产生了一种未知的代谢产物,而丁烯基多杀菌素的产量降低了81.1%。支链氨基酸降解能够产生大量的辅酶A前体,为了促进该代谢过程,本研究在发酵培养基中添加了相应的氨基酸,并进行了丁烯基多杀菌素产量和辅酶A前体浓度的测定。结果表明,一定浓度范围内的丙酰-Co A和甲基丙二酰-Co A促进了丁烯基多杀菌素的生物合成,而超过限度后,这两个前体会产生反馈抑制,导致丁烯selleck NMR基多杀菌素的产量降低。在S.pogona-Δclu13的差异蛋白质组学中,BccA蛋白的表达下调,而MmsA的表达无明显变化,为了进一步优化丁烯基多杀菌素生物合成代谢网络,将S.pogona-Δclu13作为优势底盘菌株,分别在其中过表达bcc A和mmsA基因。结果表明,相比于野生型菌株,两株工程菌中丁烯基多杀菌素产量分别提高了6.4倍和10.1倍。通过基因组精简结合多组学分析,本研究成功挖掘了几个调控丁烯基多杀菌素产量的关键基因,发现了氨基酸降解途径与丁烯基多杀菌素生物合成的密切联系,并通过组合优化策略改善了丁烯基多杀菌素的合成代谢网络,构建了两株极具生产潜力的工程菌。这项研究为构建优势底盘菌株和优化天然产物的代谢网络提供了研究基础,拓展了氨基酸降解和前体供应在次级代谢产物生物合成中的研究思路,也为筛选关键基因以及高效构建生产菌株提供了借鉴和指导。