目前国内外对鸭源坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)相关研究较多,而对鸡源宿主的坦布苏病毒流行情况及特点研究较少,为了进一步研究鸡源TMUV的流行病学和进化特点,本研究成功分离一株鸡源TMUV并命名为CK/HB/2021,分析了该分离株E蛋白和NS1蛋白的遗传进化特点以及氨基酸位点变化。另外将TMUV E蛋白及其结构域Domain I、DomainⅡ和DomainⅢ(简称D I、DⅡ和DⅢ)真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(DF1),过表达24h后感染TMUV,q RT-PCR测定E蛋白对RLR信号通路主要免疫相关因子的影响和病毒在DF1细胞中的复制情况。通过探究E蛋白对RLR信号通路的影响,进而探究E蛋白在坦布苏病毒复制过程中如何发挥作用。本研究内容主要分为以下2个方面:1.鸡源TMUV的分离鉴定及E基因和NS1基因序列分析采集疑似感染坦布苏病毒病死鸡的卵巢,研磨后在无菌条件下接种于9-11日龄SPF鸡胚,之后盲传3代,无菌收集尿囊液。RT-PCR方法扩增TM购买ABT-199UV分离株E、NS1基因片段,并对PCR阳性产物进行测序分析。所得毒株命名为CK/HB/2021,将其序列与从Gen Bank上下载2011-2021年20株不同宿主TMUV参考毒株(BYD-1、CK-SD-11、Duck EDS virus、HD1-2013、LQ-1、SDHS、SDMS、Du-CH-LSD-P30、AH2011、JS201501、JSGo、JS06、SDLC、JS-S1、GD06、FQ-C1、GA、AQ-19、CHN-JL)BioMark HD microfluidic system比较分析。分析结果显示,本实验分离株与所选TMUV参考毒株E蛋白核苷酸及氨基酸同源性分别为95.8%-98.9%、98%-99.6%;NS1基因序列核苷酸及氨基酸同源性分别为94.3%-98.3%、95.5%-98.6%,同源性较高。另外分离株E蛋白的第122、194、277位氨基酸发生了变化,分别是T~(122)S、S~(194)F、S~(277)N;NS1蛋白的第165、211、221、273、293位氨基酸发生了变化,分别是T~(165)A、K~(211)T、K~(221)R、I~(273)T、D~(293)G,实验结果表明E基因序列同源性差异性较小,NS1基因序列变化最大。2.坦布苏病毒E蛋白对病毒复制影响的研究将pEGFP-N1-E、p EGFP-N1-E/DI、p EGFP-N1-E/DII、p EGFP-N1-E/DIII和p EGFP-N1真核表达质粒转染DF1细胞24h过表达后用TMUV感染细胞;TMUV直接感染DF1细胞作对照(共六组),在病毒感染3、6、12、24h后收集细胞,q PCR检测RLR信号通路相关因子(LGP2、MDA5、MAVS、STING、TRAF3、TRADD、TBK1、IKKα、IRF3、IRF7、IFN-α/β、NF-KB/p65、STAT1)m RNA的转录水平情况,并检测病毒在DF1细胞中的复制情况如何。q RT-PCR结果显示:在病毒感染3、6、12、24h后E蛋白及其结构域E/DI、E/DII、E/DIII均能抑制RLR信号通路相关因子LGP2、MDAselleck产品5、MAVS、STING、TRAF3、TRADD、TBK1、IKKα、IRF3、IRF7、IFN-α/β、NF-KB/p65、STAT1的m RNA的转录水平,并且E蛋白在病毒感染期间能够促进病毒在DF1细胞中的复制,说明E蛋白在TMUV病毒感染期间可以通过显著拮抗RLR信号通路来促进病毒在DF1细胞中的复制。